荧光定量PCR常见问题解答

4 不可忽视实验过程中的操作细节

如果以上都正常，还要确定下实验过程中的操作细节。比如从冰箱冷冻中取出的试剂是否有混匀，如果试剂融化后没有混匀，这时候取出的试剂不是均一的，会影响后面的扩增；定量PCR预混液跟核酸模板加好后是否混匀，如果没有混匀，特别是样本体积比较大的时候（超过PCR体系的20%），更容易发生optical mixing现象。因为样本是水相会在上层，试剂（含有甘油成分）会在下层，在前期的PCR过程中不足以混匀完全，这样会形成折射，荧光较强，而一般加热几个循环后样本跟预混液会混匀，荧光就变稳定了。

如上图所示：样本跟预混液未混匀现象

还有上机的反应体系里不要有大的气泡，有气泡的话，中间容易形成折射，干扰荧光的采集。所以实时荧光定量PCR实验的细节还是要特别注意的。

如上图所示：反应体系中有气泡

其他问题可以用梯度实验摸索最适合的退火温度，另外可使用标准曲线来确保整个反应体系的扩增效率，好的扩增效率在90%-110%之间，如果没有达到，需要重新优化整个反应体系与步骤，确保实验的稳定性。

以上是我们在面对常见的一些异常扩增曲线的分析思路，希望能够帮助各位老师处理扩增曲线异常的问题。除了我们提到的几种情况之外，在平时实验过程中我们可能还会遇到各种千奇百怪的结果，大家可以利用上面介绍的思路加以分析。

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