荧光定量PCR常见问题解答

（七）扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？

1. 参比染料设定不正确；

2. 模板的浓度太高或者降解；

3. 荧光染料的降解；

（八）怎样判断定量pcr仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？

1. 一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物；

2. 另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染；

清除样本加热块污染的步骤如下：

用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中；

吹打数次；

将废液吸入废液杯中；

重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次；

确认反应孔中的残留液体蒸发完；

（九）内标法和外标法哪种数据更精密？

是同样可靠的。

内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的PCR效率有差异。

外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的PCR效率有差异。

两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。

二、荧光定量PCR异常扩增曲线案例分析攻略

1 软件设置是否正确

请对照试剂盒说明书，检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。如需进行ROX校正的，需要看下所选用的试剂中是否含有ROX来作为参比荧光染料。目前市面上主流荧光定量PCR仪器都不需要ROX来校正，如需进行ROX校正的，需要确保试剂Mix里面含有ROX染料。

经常有一些结果，很明显的阴性样本，但是扩增图谱的扩增曲线抬升了，这样就会与阈值线相交，有了CT值。

如图：基线自动扣除错误，导致扩增曲线异常

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