荧光定量PCR常见问题解答

一、荧光定量PCR异常扩增曲线常见问题

qPCR虽然简单，但是难免会出现一些小问题，接下来就谈谈可能会出现哪些问题，以及这些问题该如何解决：

（一）无Ct值出现

1. 检测荧光信号的设置步骤有误，一般来说荧光信号收集在延伸步骤；

2. 引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；

3. 模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；

4. 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况；

5. 循环数不够；

6. 模板量太低；

7. 上下游引物Tm值差异太大；

（二） Ct值出现过晚（Ct>38）

1. 扩增效率低: 反应条件不够优化，设计更好的引物或探针，改用三步法进行反应，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；

2. PCR各种反应成分的降解或加样量的不足；

3. PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度；

5. 引物或者模板降解；

6. PCR体系，比如镁离子浓度；

（三） 标准曲线线性关系不佳

1. 加样存在误差：使得标准品不呈梯度；

2. 标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品；

3. 引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针；

4. 模板中存在抑制物，或模板浓度过高；

（四） 对照有信号

1. 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；

2. 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；

3. 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒；

4. 模板有基因组的污染；

（五） 溶解曲线不止一个峰

1. 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；

2. 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；

3. 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的试剂盒；

4. 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入；

5. 引物非特异扩增；

（六） 扩增效率低

1.反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解；

2. 反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法；

3.反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响；

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