鸡传染性支气管炎诊断技术研究进展

3.2 血清学诊断

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） ELISA是目前应用最广泛的IBV抗体血清学检测方法，常用完整的IBV病毒粒子和重组蛋白作为抗原。哈尔滨兽医研究所已经开发出检测结果可靠、成本低的ELISA抗体检测试剂盒，能在短时间内进行大规模筛查。一般建议在疑似感染时和1周后各检测1次。ELISA检测成本低、简便易操作，能应用于早期和长期感染时的抗体检测。苗立中等依靠截短表达的S1蛋白开发的间接ELISA抗体检测方法，可应用于IBV免疫抗体检测和感染快速诊断。将基于IBV S蛋白保守序列的合成肽与ELISA结合，能特异性检测不同基因型的IBV抗体。Finger等将ELISA与蛋白质印迹法（western blot，WB）相结合检测IBV N蛋白抗体，发现该方法的敏感性和特异性均大于90%，还能检测到商品试剂盒检测不到的抗体，将ELISA与WB结合起来能有效提高诊断的灵敏度，降低假阴性出现的概率。

血凝抑制试验（heamagglutination inhibition test，HI） IBV无血凝素，不能凝集动物红细胞，因此需要进行特殊处理使其具有血凝活性。Hussian等对比胰蛋白酶、神经氨酸酶、磷脂酶C处理制备的抗原，发现经磷脂酶C处理制备的抗原更适合用于HI快速诊断IBV。庄金秋等将鸡胚培养增殖的IBV M41株尿囊液上清，经聚乙二醇处理后与魏氏梭菌（含α毒素）按一定比例混合处理后制成HI抗原，发现该抗原效价好、稳定性可靠，可以应用于鸡群IBV疫苗免疫后血清抗体及卵黄抗体的检测。HI成本低、所需设备简单、耗时较短，不仅能应用于大规模鸡群的IBV筛查，还能用于疫苗免疫后抗体效果评价。

病毒中和试验（virus neutralization test，VNT） VNT具有高度的特异性，能够区分基因型和测定血清中抗体效价，因此常被应用于IBV的变异鉴定以及疫苗免疫效果评价。常用的操作方法有两种：用已知浓度血清与不同稀释度病毒反应（α法）和用已知病毒量与不同稀释度血清反应（β法），其中α法更准确可靠。Zhou等从H120和4/91免疫鸡群中分离出一株IBV毒株（CK/CH/2010/JT-1），利用VNT发现两种疫苗不能形成有效保护，经测序后发现这是一种新的基因型。VNT比HI更灵敏，但是耗时且缺乏标准化，建议选用更成熟的ELISA。

免疫组织化学技术（immunohistochemistry，IHC）IHC是基于抗原抗体反应，根据标记物的性质差异进行检测的技术。应用于IBV检测的主要分为两种：免疫荧光组织化学技术和免疫酶组织化学技术。这两种是从组织（细胞）样品中检测IBV抗原的重要方法。亲和素-生物素复合物（ABC），已被成功用于组织样本中定位IBV抗原。IHC可以在IBV感染的各个阶段观察到组织的病理变化情况，但是不能有效区分血清型和毒株。通过IHC对两株IBV毒株进行致病力研究，发现IBV S蛋白首先在气囊内侧纤毛细胞中被检测到。Abdel-moneim等应用IHC在接种IBV M41的鸡胚多个组织中检测到IBV抗原，说明IBV具有广泛的组织嗜性。近年来，随着分子生物学的发展，IHC更多的应用于IBV的组织病理学研究，而较少应用于IBV现场诊断和筛查。

3.3 分子生物学诊断

反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR） RT-PCR是分子生物学常规的检测方法，通过快速扩增目的片段，结合琼脂糖凝胶电泳实现对病毒的快速诊断。Fellahi等建立了一种SYBR green I RT-PCR检测IBV的方法，与常规RT-PCR相比具有较高的特异性，且灵敏度高10倍，适用于IBV的常规检测。Xiu等建立了能检测包括IBV在内的目前已知的14种冠状病毒的半巢式RT-PCR，检测限为4×（100~102）copies/μL，与测序结果相比具有良好的一致性，但是操作复杂，不适用于大规模筛查。该方法在扩增后还需进行琼脂糖凝胶电泳，操作繁琐、耗时长，因此大规模筛查时建议使用易操作省时的多重PCR或常规RT-PCR。

多重PCR（multiplex polymerase chain reaction） 多重PCR是通过在一个反应体系中加入两对以上引物，实现对多个病原检测的方法。高文倩等将免疫磁珠富集应用于IBV检测，建立了检测IBV强毒株与弱毒疫苗株的多重PCR，经富集后的方法灵敏度提高了100倍，特异性良好，在临床上有较高的应用价值。Laamiri等建立了能同时检测AIV、IBV、NDV和ILTV的多重实时RT-PCR，检测结果与独立检测结果一致。该方法能同时检测4种病原，并且具有耗时短、准确度高的优点，适用于禽类养殖场常规疫病筛查。Cong等首次结合x-TAG磁珠开发了鉴别AIV、NDV、IBV和ILTV的多重PCR，检测限为6.75×102~3.52×103 copies/μL，具有通量高、耗时短、灵敏度高的优点。多重PCR更适用于在疑似混合感染群体中进行筛查，能有效降低筛查成本。

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