非瘟核酸检测实验室污染源及防污染措施

3.  避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；

4.  操作多份样品时，制备反应混合液，先将检测试剂（dNTP、缓冲液、引物和酶）混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；

5.  最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；

6.  操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；

7.  尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；

8.  重复实验，验证结果，慎下结论。

三、实验室污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

对照试验：

1、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验实验室都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功的一个重要的参考标志。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2、阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。

3、重复性试验

四、实验室污染的消除

实验室一旦发生污染，检测工作应立即停止，直到确认消除污染后才能重新开始检测。首先，要查找污染源和明确污染范围。然后，根据污染源和污染范围采取有效的去污染措施，结合各种不同方法以达到最佳效果。

1. 标本污染生物安全柜的操作台造成局限污染时：

立即用吸水纸覆盖，并使用0.55%含氯消毒剂进行喷洒消毒。消毒液需要现用现配，24小时内使用。

2. 标本倾覆造成实验室污染时：

保持实验室空间密闭，避免污染物扩散。立即使用润湿有0.55%含氯消毒剂的毛巾覆盖污染区。

3. 清理污染物时：

严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。

五、非瘟病毒核酸检测常见问题

1、非瘟试剂出现翘尾，怎么处理？

答：如果是个别单一通道翘尾，不管是FAM还是VIC通道，首先按照要求复查，复查建议重新采样，如果不方便重新采样建议对原有样本进行重新提取核酸验证，如果复查阴性判读阴性，如果复查还是同一通道翘尾，就要对结果仔细审核，一是要排除实验室污染，二是要对猪只信息了解清楚，从临床症状等排查，如果没法确认，建议必须重新采样复查。如果出现大量的弱阳性扩增翘尾，首要原因是考虑实验室污染，可以通过做环境样本和阴性对照做验证排除。

2、非瘟检测结果和临床症状不符合，怎么解读？

答：检测结果和取样、核酸提取以及样本本身的核酸浓度有关，需要逐一分析，同时可以结合临床症状判读。或者通过检测非瘟抗体验证检测结果。

最后是两条有用的小诀窍：

● 面对多份样品，制备反应混合液时，先将 检测试剂（dNTP、缓冲液、引物和酶）混合好，然后用分液功能进行分装。

● 在加入模板时，按照“阴性对照-待测样品-阳性对照”的加样顺序，操作上应遵循“开管盖-加模板-盖管盖”的原则。

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