非瘟核酸检测实验室污染源及防污染措施

近期随着季节的变化，逐步降温，养猪企业防控非瘟疫情的任务非常严峻，核酸检测能力已然成为了我们养猪人必须掌握的基本技能，核酸检测实验室污染问题也是大家比较关心的话题。

本文整理总结了核酸检测实验室污染原因、防污措施、污染的监测及解决方案等问题

一、PCR 实验室的潜在污染来源

①唾液、血液、环境标本中存在的大量待测靶核酸（非瘟病毒、非瘟核酸）

②以前扩增产物的残留污染,这也是 PCR 实验室最容易产生的将造成假阳性的“污染”。

PCR扩增可以引起实验室中扩增产物的累积,通常一次典型的PCR 扩增可以产生109拷贝的靶序列,如果气溶胶化,甚至最小的气溶胶都会含有106拷贝的扩增产物。如果不加以控制,在短期内累积的气溶胶化的扩增产物即会污染实验室中的试剂、仪器设备和通风系统,从而造成严重的实验室“污染”,出现大量的假阳性结果。

二、PCR 实验室的防污染措施

进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。

(一) 划分操作区

目前，要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：

1.  试剂准备区。

2．标本制备区（样本处理区）。

3.  PCR扩增区及分析区。

各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：试剂准备→标本制备→PCR扩增区及分析区。

切记：任何一间的产物及器材不要拿到其他两个工作区。

(二) 分装试剂

PCR扩增所需要的试剂均应在生物安全柜、装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA。

(三) 实验室的严格分区及工作程序的严格遵守

试剂准备区、样本准备区、扩增区、检测区等必须备有其各自必需的仪器设备、工作服、手套、加样器和通风系统。在每个区使用的试剂和废物,必须直接在其各自的区域内分装或包装。操作人员必须注意防止通过他们的头发、眼镜、首饰和衣服将扩增产物从污染区携带至清洁区的可能性。

(四)化学方法

实验台面可使用10%的次氯酸钠(漂白剂)清洗,然后再用70%乙醇或清水洗去次氯酸钠。次氯酸钠具有氧化损伤核酸的作用,从而使可能的留在实验台面的扩增产物被破坏掉。

要注意的是,次氯酸钠不能区分提取的目的 DNA 和 PCR 扩增产物,用次氯酸钠处理的样本不能用于核酸扩增检测。

在实际工作中,有些物品比如放置扩增反应管的盘必须从污染区转回到清洁区时,在转回之前,应将其置于2%~10%的次氯酸钠溶液中过夜,并充分冲洗。

(五) 实验操作注意事项

尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：

1.  戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；

2.  使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；

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