七类消毒剂对非瘟病毒荧光定量PCR检测结果的影响

1.6　消毒剂与 ASFV 作用

采用 PBS 10 倍连续稀释经病毒滴度测定后的ASFV 培养物，取 101~104 倍稀释液备用。参考农业农村部文件《关于在非洲猪瘟防控中做好消毒剂选择工作的通知》（农牧便函〔2019〕735 号），以有效灭活 ASFV 为目的，基于畜禽栏舍、运载工具、器具消毒及皮肤黏膜（部分含碘类消毒剂适用）等不同消毒场景，按消毒剂说明书标明浓度范围合理选择工作浓度，并将消毒剂原液制成 10 倍工作浓度备用。将 0.1 mL 消毒剂 10 倍工作浓度液和0.1 mL 不同稀释度病毒液分别加入到 0.8 mL PBS中充分混合，20 ℃条件下作用 30 min，作用后产物直接用于后续测试。无法制成 10 倍工作浓度液的含碘类消毒剂 C1，按照 1:2 工作浓度，将 0.5 mL消毒剂原液和 0.1 mL 不同稀释度病毒液，分别加入到 0.4 mL PBS 中充分混合，按相同条件作用处理，作用后产物直接用于后续测试。阳性对照组，直接将 0.1 mL 不同稀释度病毒液加入 0.9 mL PBS中充分混合；阴性对照组，直接取 1 mL PBS。阴、阳性对照均按相同条件作用处理，作用后产物直接用于后续测试。

1.7　病毒 DNA 提取

取200 μL上述作用后产物， 按病毒 RNA/DNA 提取试剂盒说明，于 Thermo 自动核酸提取仪上提取病毒核酸，将提取的核酸保存于 -80 ℃冰箱备用。

1.8　荧光定量 PCR 扩增

采用 OIE《陆生动物诊断实验和疫苗手册》（2012 版）第 2.8.2 章节中，King 等基于 VP72蛋白建立的 ASFV 荧光定量 PCR 方法检测。上、下游引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。PCR 反应体系为：2×qPCR 预混液 10 µL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.8 µL，探针（10 μmol/L）0.4 µL，模板 DNA 2 μL，最后用灭菌水补齐至20 μL。反应条件为：50 ℃孵育 2 min；95 ℃预变性 3 min；95 ℃预变性 15 s，58 ℃退火延伸 1 min（采集 FAM 荧光信号），共 40 个循环。

1.9　检测结果分析

按 1.6—1.8 步骤，重复处理各组样品 3 次并检测，统计平均 Ct 值，计算批间变异系数；取同一批次提取核酸重复检测 3 次，统计平均 Ct 值，计算批内变异系数。统计各组检测平均 Ct 值，将各组检测结果分别与对应阳性对照组比较，采用SPSS 21.0 软件进行单因素方差分析，以 P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　病毒滴度测定

经测定，ASFV 培养物病毒滴度为 107.2HAD50/mL。采用 PBS 10 倍连续稀释后，本试验中与消毒剂作用的 ASFV 滴度为 102.2~105.2HAD50/mL。

2.2　各消毒剂检测结果

消毒剂在选定稀释度下与不同滴度 ASFV 作用后，采用荧光定量 PCR 检测，结果详见表 2。重复处理样品检测 3 次，各组平均 Ct 值批间变异系数为 0.3%~6.7%；取同一批次样品提取病毒核酸重复检测 3 次，各组平均 Ct 值批内变异系数为0.1%~2.3%。

 表2　荧光定量 PCR 检测结果

首页前一页123后一页尾页