做qPCR，不要钻进“唯Ct值”的牛角尖！

试验结果：

（1）最低检测限：40个循环和45个循环的最低检测限均为3 copies/μL ；

（2）低浓度模板的阳性检出率：2，1，0.5 copies/μL的阳性检出率完全相同，分别为90%，70%，60%；

（3）平均值，SD，CV：将两者平均值做配对T检验的P值为0.002，差异极显著，45个循环的平均值普遍比40个循环的平均值高0.35-1.22，而SD和CV均无显著性差异。

（4）Ct值40以上的结果：仅有一个值为40.53。

试验结论：

通过增加循环数不能提高试剂本身的最低检测限和对低浓度样品的检出率。循环数增加是否会增加非特异扩增的概率，本次试验未进行验证。

三、再多说几句

1.每个qPCR试剂盒在上市前应该按照行业统一的标准进行各种指标的系统评估，试剂盒生产厂家应该提供这些参数供客户进行选择和验证。检测实验室也应该具备对试剂盒进行性能验证的能力。

2.一个qPCR试剂盒的核心是引物探针设计、酶、反应体系和最优的反应条件，试剂盒生产厂家应该从根本上去改进自己的试剂盒而不是做一些文字游戏。

3.对于检测来说，qPCR试剂盒只是其中的一个环节，如果想得到可靠的检测结果还需要对采样、运输、保存、处理、提取和扩增的每个环节进行质量控制（检测全流程质量控制）。实验室的检测人员也不要抱有解决了qPCR试剂盒的问题就解决了检测中所有问题的幻想。

【注】原霖——高级兽医师，毕业于中国农业大学，获得兽医学博士。2009年进入中国动物疫病预防控制中心，现任农业农村部兽医诊断中心（OIE猪繁殖与呼吸综合征参考实验室）病原检测室负责人。

目前主要从事兽医诊断检测用标准物质和数字PCR方法的研制。目前已经研制了兽医领域市场监督管理总局发布的非洲猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征病毒等四项核酸标准物质。建立了数十个动物疫病数字PCR方法。发布团体标准9项，申请专利10余项，发表文章10余篇。

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