做qPCR，不要钻进“唯Ct值”的牛角尖！

斜率Slope ：当扩增效率为100%时斜率为-3.32，当90%-110%时的斜率为-3.58 ~ -3.10。

3、Ct值与模板拷贝数的关系

理想情况下，qPCR的模板经过一定的循环数进行指数扩增，扩增循环数和产物量之间的关系是：扩增产物量Cn=起始模板量C1×（1+扩增效率E）^循环数n。但是由于E通常无法达到100%，并且在扩增的后期，扩增效率会逐渐降低，只有在理想的情况下才满足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始浓度差2倍。

由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定。这是目前最常用的qPCR定量的方法，即用已知浓度的标准品与未知浓度样品同时扩增，将未知浓度样品的Ct值代入该标准曲线获得未知样品浓度。分析定量时，一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量结果的不准确。标准曲线需满足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10。同时定量标准品的量值需要准确可靠。

用qPCR进行定量，理论上可行，实际上很难获得准确的定量结果。

二、关于qPCR中Ct值的几点思考

1、Ct值能否直接换算成模板拷贝数？

通过制作标准曲线（E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10）的方法可以获得未知样品的初始模板拷贝数，前提是需要样品与标准品同时扩增，定量标准品需要使用标准物质等定量准确的物质（OD260/280换算的的拷贝数误差很大），即使如此定值结果仍存在一定的误差。

2.荧光定量PCR是否为定量方法？

虽然名字里有“定量”，但是qPCR的间接定量方式又复杂，又受很多因素影响，又不准确，在计量领域是不被认可的。目前的核酸检测方法中只有数字PCR是真正的定量检测方法，其余的都是定性检测方法。

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