非洲猪瘟双基因缺失的鉴别诊断方法

深圳海关公布了一种用于非洲猪瘟病毒MGF_360-14L和CD2v双基因缺失鉴别诊断的三重实时荧光定量PCR方法，具体信息如下。

一、方法简介

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的家猪和野猪的一种传染病。在本研究中，作者建立了一种三重实时定量PCR方法来检测和区分基因双缺失的ASFV株和野生型ASFV株。本方法中，设计了3对引物和探针，分别针对B646L基因（p72）、MGF_360-14L基因（位于MGF360-505R基因中间）和CD2v基因的保守区。该方法特异性良好，可将基因缺失（MGF360-505R和/或CD2v基因缺失）和野生型ASFV株与PCV2、CSFV、PRRSV、FMDV、SVA或其他病原的核酸相互区分开。含B646L基因、MGF_-14L基因和CD2v基因的标准质粒DNA的检测限分别为7.9拷贝、9.7拷贝和9.6拷贝。采用OIE推荐的三重rPCR和本文建立的实时定量PCR方法对1215份样品进行了平行检测，两种方法的B646L基因检测结果完全一致。成功地建立了三重定量PCR检测方法，用于鉴定感染ASFV野毒株或感染ASFV双基因缺失毒株的猪只。

二、方法特点

2.1 基因缺失的ASFV减毒疫苗已成为最有前途的ASF候选商品疫苗；

2.2 区分野生型ASFV和疫苗毒株的试验方法对ASF的预防和控制至关重要；

2.3 本文采用三重实时荧光定量PCR方法检测ASFV基因组中B646L基因、MGF_360-14L基因和CD2v基因；

2.4 三重荧光定量PCR法具有良好的特异性和敏感性。

三、方法实施

3.1 引物

3.2 反应体系

最终的荧光定量PCR混合物含有THUNDERBIRD探针qPCR混合物（包括dNTPs、Mg2+、rTaq DNA聚合酶）、正向和反向引物各0.5μL（每个引物的最终浓度为200 nM）、TaqMan探针各0.3μL（最终浓度为120 nM）、DNA模板5μL，并用无核酸酶水配制至25μL。

3.3 反应条件

在合适的荧光定量仪器上可以进行荧光定量PCR反应，反应条件是如下：95°C 40 s，然后40个循环：95°C 8 s，58°C 45 s。在58°C下检测荧光信号。