山东省部分地区鸭Ⅰ群禽腺病毒的检测与分析

1.2.8　 目的片段连接　取 pMD18-T Vector0.5 μL、Solution Ⅰ 4.5 μL 及 DNA 回收产物 5 μL，配制连接体系，吹打混匀后 16 ℃反应 1 h。

1.2.9　转化　（1）将 1.2.6 中的连接产物加入到100 μL 感受态细胞中，轻轻吹打混匀后，置于冰水混合中冰浴 30 min；（2）冰浴结束后，将混合物 42 ℃热激 90 s，严格控制温度及热激时间；（3）迅速冰浴 2 min；（4）向离心管中加入 890 μL 普通 LB 液体培养基，于 37 ℃摇床中培养 45 min；（5）4 000 r/min 离心 5 min，吸弃 900 μL；（6）以剩余培养基将菌体沉淀重悬，并均匀涂布至含有氨苄青霉素（Amp）的 LB 固体平板上，于 37 ℃培养箱中正置培养至液体被全部吸收后，翻转平板，培养过夜。

1.2.10　阳性菌落 PCR 鉴定 挑取氨苄平板上的白色单菌落至 4 mL 氨苄液体培养基中，于 37 ℃摇床中培养 8 h，以增菌培养后的菌液为模板，进行PCR 鉴定，筛选阳性重组质粒。提取阳性重组质粒，送华大公司进行测序，测序结果以 DNAStar 软件进行拼接，及序列分析。与 GenBank 中已有的Ⅰ群禽腺病毒各血清型的 hexon 基因序列进行同源性比较，并进行遗传进化分析。

2　结果与分析

2.1　鸭胚胚体变化

在无菌收取尿囊液后，收集胚体观察，可见有散在的出血点；剖检可见肝脏有轻微出血点，并且同一孵化场内同日龄部分胚体出现发育障碍。

2.2　病毒检测

将采集的 581 份样品经处理后接种 LMH 细胞进行病毒分离，每日观察细胞病变，并于接毒 5 d后，收获病毒培养物进行 PCR 检测。病变观察结果显示，接种病毒后 3 d，部分 LMH 细胞开始变圆，并且成堆聚集。细胞团簇之间间歇增大。PCR检测结果显示：本研究收集鸭胚461枚中、有 173 枚呈 PCR 检测阳性，阳性率为 37.5%，最小检出胚龄为 8 日龄，最大为 28 日龄；1 日龄雏鸭共 120 羽，PCR 阳性共计 41 羽，阳性率为34.2%；从德州某种鸭场采集的 120 份泄殖腔棉拭子阳性率为 28.3%（表 2）。由结果可知，有 8 个批次的样品阳性率超过 30%，其中 2 个批次样品阳性率达到 50% 以上。

2.3　遗传进化分析

为了更好地了解本次感染病毒株与其他不同地方分离毒株之间的关系，将分离到的 4 株Ⅰ群禽腺病毒与其他 Genbank 中已上传病毒的序列，使用 MEGA 5.1 软件通过邻接法（Neighbor-Joiningmethod）进行比对分析，构建系统发育进化树。结果显示，本研究分离得到 1 株血清 1 型毒株及 3 株血清 4 型毒株。其中，SDDZ 分离株为血清 1 型，与 G026 株处于同一分支；SDLC，SDFC 及 SDXT株均为血清 4 型毒株，SDFC 株与 2008 年分离于印度的 PP-01 株遗传关系最为接近，而 SDLC 和SDXT 与近年来从我国分离到的血清 4 型腺病毒处于同一进化分支（图 2）。

图 2　各分离株遗传进化关系

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