山东省部分地区鸭Ⅰ群禽腺病毒的检测与分析

2015 年 6 月以来，我国肉鸭群中大面积暴发以心包积液为典型特征的传染病，引起肉鸭大量死亡，死亡率为 5%~20%，给我国肉鸭养殖业造成了巨大经济损失。前期研究证实，该病的病原为Ⅰ群禽腺病毒。近年来，该病在鸭群中的发病情况愈发严重，且流行范围在逐步扩大，严重威胁我国肉鸭养殖业的健康发展。

本研究通过采集山东省内几大种鸭场的种蛋及 1 日龄雏鸭样品进行Ⅰ群禽腺病毒的病原检测，对检测过程中确定的阳性样品进行病毒分离鉴定，并对病毒的 hexon 序列测序后与 Genbank 中序列进行比对分析，以期了解Ⅰ群禽腺病毒在鸭胚中的流行及变异情况，为其防控提供数据支持。

1　材料和方法

1.1　试验材料

1.1.1　试验动物、样品及细胞株　试验用各日龄鸭胚及 1 日龄雏鸭：共 581 份，采自山东省新泰、肥城、德州及聊城等地不同种鸭场（所选鸭场均未出现腺病毒疫情暴发史，存栏种鸭精神状态及采食饮水状况正常）；病毒分离所用细胞株：LMH 鸡肝癌细胞；120 份种鸭泄殖腔棉拭子：采自德州种鸭场。

1.1.2　仪器和设备　水平核酸电泳仪（北京君意）、凝胶成像仪（美国 BIO-RAD）、台式离心机（美国 BECKMAN）、 数 码 生 物 显 微 镜 BDS200-FL（重庆奥特）、高速离心机（日本HITACHI）、超净工作台（江苏 苏净安泰）、电热恒温培养箱（龙口先科）、组织匀浆机、全自动孵化器（合肥三巨）、酶标仪（美国 BIO-RAD）、PCR 仪（美国 ABI；德国 Eppendorf）、分光光度计（德国Eppendorf）、超低温冰箱（美国 Thermo）、透射电镜（日本 JEOL）、水浴锅、电子天平、照蛋灯、漩涡振荡器、打孔器、微波炉、注射器、电磁炉等。

1.1.3　主要试剂　Taq DNA 聚合酶（5 U/ μL）、dNTPs（10 mmol/μL）、10×Loading Buffer：均购自大连宝生物有限公司；琼脂糖、Tris- 平衡酚：购于北京索莱宝科技有限公司；氯化钠、SDS、乙醇、氯仿、碘酊、酒精及其他试剂：均为国产分析纯。

1.2　试验方法

1.2.1　病毒分离　采集不同日龄鸭胚，无菌收取尿囊液；或收取 1 日龄雏鸭肝脏，加入 DMEM 进行匀浆处理；将组织匀浆冻融 3 次后离心取上清，经 0.22 μm 滤器过滤除菌。取长满单层的 LMH 细胞，用无菌移液管，将 DMEM 从细胞培养瓶中移出后，用无菌 PBS 溶液清洗细胞 2~3 次；取尿囊液或过滤除菌的组织匀浆500 μL置于细胞培养瓶中，37 ℃吸附 2 h；吸附结束后，弃去吸附液，重新加入 5 mL 含 2% 小牛血清的 DMEM 培养液于培养瓶中；每日观察细胞病变；于接种 5 d 后收获细胞培养物。

1.2.2　样品 DNA 提取　参照分子克隆实验指南。

1.2.3　样品 PCR 鉴定　以 1.2.1 中提取的样品DNA 为模板进行 PCR 扩增。反应体系：DNA 模板 2 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP（10 mmol/μL）2 μL、Taq 酶 0.5 μL，上下游引物各 1 μL，而后以双蒸水补足至 25 μL。PCR 反应程序：95 ℃预变性 10 min，而后 95 ℃变性 1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 45 s，30 个循环后，72 ℃延伸 10 min。

1.2.4 hexon 基因扩增及测序分析　将步骤 1.2.2中鉴定为阳性的 DNA 样品，针对 hexon 序列进行PCR 扩增，并对其片段进行测序。根据 Genbank上已有腺病毒 12 个血清型的禽腺病毒毒株 hexon序列设计了 4 对特异性引物，对其全序进行 PCR扩增，而后将目的片段与 pMD18-T 载体进行连接，并转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，经过增菌培养后，提取质粒送至华大公司进行测序。

1.2.5　病毒 DNA 提取　该步骤同 1.2.1。

1.2.6 hexon 基因的 PCR 扩增

1.2.6.1　引物的设计与合成　根据 Genbank 上已有腺病毒12个血清型的禽腺病毒毒株hexon序列，使用 Primer 6.0 设计了 4 对特异性引物。引物序列见表 1。该引物可扩增 hexon 基因全长序列。引物合成交由华大公司。

1.2.6.2 PCR 扩增　PCR 扩增反应采用北京全式金公司 TransTaq DNA Polymerase High Fidelity 反应体系：阳性 DNA 模板 2 μL，10×Transtaq HiFibuffer 2.5 μL，2.5mmol/L dNTPs 2 μL，TranstaqHiFi DNA Polymerase 0.3 μL，上游及下游引物各1 μL，补水至 25 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性10 min，而后 95 ℃变性 1 min，57 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 45 s，30 个循环后，72 ℃延伸 10 min。

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