一例猪伪狂犬病和副猪嗜血杆菌病混合感染的诊治（图）

3、实验室诊断

3.1 细菌分离培养鉴定

确保整个实验过程严格执行无菌操作。

1）病料采集：无菌采集该病死猪的气管、肺脏和关节液于灭菌容器内备用。

2）实验材料：胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、麦康凯琼脂、普通营养琼脂、NAD（V因子）、新生牛血清、细菌微量生化反应管、革兰氏染色试剂。

3）实验步骤：用灭菌接种环挑取气管内容物、肺脏深部刮取物、关节液三种病料分别接种在三个加有5%牛血清+0.005%NAD的 TSA在平板上，置于37℃恒温培养箱中培养24h，观察结果。

菌落形态：三个平板上均长有光滑、圆形、边缘整齐、灰白色、半透明、中等大小的菌落。

培养特性：用灭菌接种环挑取该分离菌单个典型菌落分别接种在5%牛血清+TSA +0.005%NAD平板、5%牛血清+TSA平板、普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板上，置37℃恒温培养箱中培养24h，观察：该菌只能在TSA+牛血清+NAD（V因子）平板上良好地生长，其余三种平板均无细菌生长，说明此菌为“嗜V因子生长菌”。

革兰氏染色镜检：挑取典型菌落，革兰氏染色后显微镜下观察，该菌呈多形性，丝状、纤细长杆菌、纤细短杆菌、小球杆菌或小球菌为淡红色的革兰氏阴性菌（G-）。

生化试验鉴定：该菌尿素酶试验阳性、接触酶试验阳性，氧化酶试验阴性。能发酵蔗糖、葡萄糖，不发酵山梨醇、甘露醇。

根据以上鉴定结果判定，该菌为副猪嗜血杆菌。

3.2 猪伪狂犬野毒感染检测

1）组织病原学检测

①样本制备：无菌采集病死猪的颌下淋巴结、扁桃体、脑、脾脏适量，混合研磨、离心、制备，取上清液备用；

②实验操作步骤（略）。用猪伪狂犬病毒（gE基因）实时荧光PCR检测试剂盒（世纪元亨）检测上述组织中猪伪狂犬病毒gE基因。结果判定：被检样品阈值（Ct值）≤30并出现特定扩增曲线的为PRV阳性；

③检测结果：该样本Ct值=20.37＜30并出现特定扩增曲线，PRV核酸阳性，表明该猪感染伪狂犬野毒。

2）猪伪狂犬病毒gE抗体检测

①需要抽取样本量（n）的确定。根据公式n={1-（1-α）1/D}×{N-（D-1）/2}，计算n=58（其中，N-群体数量=900，P-预期流行率=5%，M-检测方法（ELISA）敏感性=98%，α-置信水平=95%，D=N×P×M）；

②样本制备：用5mL一次性采血器，猪前腔静脉采血，随机抽取58份血样，3,000r/min，离心5min，制备血清；

③实验操作步骤（略）。采用IDEXX猪伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒。使用前，所有试剂和微量包被反应板一律恢复至室温（18～26℃），并通过轻轻涡旋、旋转或颠倒混匀。整个实验过程严格操作程序，且不同的样本和试剂使用不同的吸头。结果有效性：阴性对照N（OD650）的平均值（0.873）减去阳性对照P（OD650）的平均值（0.162）等于0.711，大于0.300，试验成立。计算S/N值，即样品S（OD650）与阴性对照N（OD650）的平均值之比。结果判定：被检样本S/N值≤0.60的，该样本判为阳性，即被伪狂犬野毒感染；被检样本S/N值＞0.60，该样本判为阴性；被检样本0.60＜S/N值≤0.70，判为可疑；

④检测结果：58份被检血清样本，23份样本猪伪狂犬病毒gE抗体阴性，35份样本猪伪狂犬病毒gE抗体阳性，表明该猪群已受到伪狂犬野毒侵袭。

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