常见猪病毒性疾病及其检测方法研究进展

2.2 免疫学检测

常见免疫学检测技术包括酶联免疫吸附法（ELISA）和胶体金免疫技术。

1）酶联免疫吸附法（ELISA）。酶联免疫吸附法的基础是抗体（抗原）的固相化及抗体（抗原）的酶标记，基本原理是将一定浓度的抗体（抗原）吸附在固相载体（最常见的为聚苯乙烯）的外表面，且要维持抗体（抗原）的免疫活性，并通过共价键形成酶标抗体（抗原）；样本（抗原或抗体）加入后，与固定板上的酶标抗体（抗原）结合形成酶标复合物，可依据酶标复合物显色的深浅来判断是否发生了免疫反应以及相应抗体（抗原）的量的多少，以此来进行定性或定量的分析。文献采用抗猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的N蛋白单克隆抗体来建立检测PRRSV抗体竞争性的酶联免疫吸附法，该方法具有高敏感性和高特异性，与IDEXX的PRRSV ELISA的检测结果符合率>90%；文献以口蹄疫病毒VP1重组结构蛋白为抗原建立猪口蹄疫病毒抗体的间接酶联免疫吸附检测法，与液相阻断ELISA的检测结果符合率为96.25%，与HA的检测结果符合率为96.2%，与上海优耐特FMDV VP1 ELISA检测结果符合率为87.27%；文献以乙型脑炎病毒弱毒疫苗株作为诊断抗原来建立猪乙脑病毒血清抗体间接酶联免疫吸附检测法，研究者将其对相关地区的猪乙型脑炎血清抗体进行检测，和市售的试剂盒比较，结果符合率为95.6%，与以NS1蛋白包被建立的酶联免疫吸附检测法比较，结果符合率为97.7%。

2）胶体金免疫技术。胶体金是氯金酸在还原剂的作用下，聚合成带负电的稳定的疏水金颗粒胶溶液，金颗粒表面的负电荷，能够和多种生物高分子物质的正电荷基团因静电吸附作用而牢固结合，这种结合不会影响其生物特性，因此被视为免疫反应的理想标记物。胶体金标记技术以胶体金作为示踪标志物，用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，主要包括斑点免疫金渗滤法（dot immunogold filtration assay，DIGFA）和胶体金免疫层析法（immunochromatographic test strip，ICST）。文献选择致病性猪圆环病毒的Cap蛋白，建立了致病性猪圆环病毒的胶体金免疫层析检测法，与市售ELISA试剂盒比较，对相关血样的检测结果符合率达到94%。文献建立了O型口蹄疫病毒的胶体金免疫层析检测法，可在5min内完成检测，并与其它病毒抗体无交叉反应，灵敏度为95%，与市售ELISA试剂盒的检测效率相当。文献则建立了基于N蛋白的PRRSV胶体金免疫层析检测法，灵敏度为97.5%，特异性为91.1%，与市售ELISA试剂盒的检测效率相当。文献建立了基于CnC2蛋白的CSFV胶体金免疫层析检测法，灵敏度为97%，特异性为100%，与市售试剂盒的检测效率相当。文献[17]研发了一种PRV荧光免疫层析检测试纸条（F-ICS），最低检测限度为0.13ng/mL，检测线范围（DLR）为0.13～2.132 ng/mL，最低检测限比普通的试纸条还低10倍，与PCR的检测结果一致。

免疫学检测技术在猪疫病检测中应用广泛，其具有快捷简便，结果直观，安全无污染，经济实惠等优点；但每次仅能检测单样本，通量低，且无法进行定量检测，其灵敏度、特异性亟待加强以满足市场的高要求。

2.3 分子生物学检测

常见分子生物学检测方法有荧光定量PCR（qPCR）技术、多重PCR技术、恒温扩增技术、基因芯片技术等。

1）荧光定量PCR（qPCR）技术。荧光定量PCR是通过荧光染料或者荧光标记的探针，在整个PCR过程中标记跟踪PCR产物，最终实现定量分析模板的方法。由于其定量准确、灵敏度及特异性高等优点，被广泛应用于多种猪病毒的鉴别诊断，是目前最常用的诊断方式。

2）多重PCR技术。多重PCR是将多对引物加入到同一个PCR体系中，同时扩增出多个核酸片段的方法，因而广泛应用于多种病原微生物的同时检测。文献针对TGEV的N基因、PEDV的M基因、猪A群轮状病毒的VP7基因设计了特异性引物，成功建立了可以同时检测PEDV、TGEV和猪A群轮状病毒的多重RT-PCR方法；文献建立的EvaGreen多重实时荧光PCR体系可同时检测包含猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒II型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、日本脑炎病毒（JEV）、伪狂犬病病毒（PRV）在内的6种常见猪病毒，结果显示6种猪病毒在EvaGreen多重实时荧光PCR中均无非特异性扩增且灵敏度可达100～500copies/μL；且批内和批间重复的Tm变异系数均在5%以内。

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