荧光PCR的12种异常扩增曲线分析​

编者语：非洲猪瘟暴发以来，荧光PCR核酸检测已经成为防非工作必不可少的一环。随着检测工作的进行，检测人会发现检测结果不仅仅是ct值有无那么简单，对荧光PCR结果最直接的判断是扩增曲线，而非ct值。在检测过程中，我们不可避免地会遇到一些奇奇怪怪的曲线，如何正确解读这些曲线并且做出恰当的解决方案是我们一线检测人需要练就的基本功。

实时荧光定量PCR技术是目前检测非洲猪瘟病毒核酸的主要方法，该技术是通过监测PCR过程中所加入荧光基团的荧光信号,利用已知浓度的标准品绘制标准曲线,对未知样品进行定量和定性分析的一种核酸检测技术。在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过循环阈值( Cycle threshold，Ct) 和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。

PCR扩增过程中，每一轮循环均检测一次荧光信号的强度。随着反应循环次数的不断增加，所扩增的目的基因片段呈指数规律增长，反应中产生的荧光信号强度与PCR产物的数量呈正比。仪器实时检测和采集的荧光信号，随着时间和循环数的不断增加，产生一条反映实时荧光信号强度变化的曲线，称为扩增曲线。扩增曲线以循环数为横坐标，荧光强度为纵坐标。

样本扩增曲线是反映PCR进程的镜子，我们可以通过观察扩增曲线来评估PCR扩增效率，分析反应是否顺利进行。扩增曲线的正常与否，反映出反应中存在的诸多因素和问题，对非洲猪瘟病毒核酸检测结果判读至关重要。

一、正常状态扩增曲线

正常PCR扩增曲线呈“S”型，分为基线期、指数期、线性期、平台期。扩增曲线良好的指标是曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象。

图1 正常扩增曲线

理论上，PCR每个循环后扩增产物量即增加一倍，扩增曲线应表现为荧光值随着循环数增加而不断上升，而实际上扩增曲线的荧光值并不会随着循环数的增加而无限上升。这是由于PCR扩增进行到一定阶段，反应体系中的原料发生消耗和变性，如dNTP和酶等原料相对于模板大大减少，同时酶活性逐渐达到饱和；引物二聚体和反应亚产物（如焦磷酸）的产生也会抑制扩增反应；引物和已扩增的DNA片段间的竞争等，都会导致PCR的扩增效率逐步降低，直至为0。因此，扩增曲线表现为扩增到一定的循环数后，荧光值不再随着循环数发生变化，而是保持平坦，出现平台期。

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