非洲猪瘟病原学检测技术研究进展

2.3 微流控芯片法

微流控芯片技术是将样品前处理、反应、分离及检测等过程集成到几平方厘米的芯片上，自动完成分析全过程，实现了分析微型化、自动化、集成化和便携化的一种新技术。Jia 等针对ASFV 的 B646L 基因设计了一对特异性引物，结合探针建立了纳米微流控数字 PCR。该方法的检测限为 30.19 copies/mL，比 OIE 推荐的 qPCR 高约33 倍。用该方法与 OIE 推荐的 qPCR 同时检测 69份灭活的临床血清样本，发现两种方法具有良好的一致性（91.30%）。为评估微流控芯片法在 ASFV核酸快速检测中的效果，邵靓等用 ASFV 微流控芯片快速检测试剂盒和市场上 ASFV qPCR 检测试剂盒，对 43 份临床样本进行检测比对，发现微流控芯片法可以在 15~30 min 内检出，最低检出限为 2.5 copies/uL，与 qPCR 具有良好的一致性（97.67%）。该方法具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、便于携带等优点，但需要特定的设备，检测成本高，难以被推广。

2.4　等温扩增技术

等温扩增技术是一种新兴的分子生物学核酸检测方法，有环介导等温扩增（loopmediatedisothermal amplifi cation，LAMP）、重组酶聚合酶等温扩增（recombinase polymerase amplifi cation，RPA）、重组酶介导等温扩增（recombinase aided amplifi cation，RAA）和酶促重组酶扩增（enzymatic recombinase amplifi cation，ERA）4 种。等温条件下，在特异性引物、酶等物质的作用下实现体外核酸扩增，再结合琼脂凝胶电泳、实时荧光和测流层析试纸条以及规律成簇的间隔短回文重复（clustered stered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）4 种方式，可呈现检测结果。Yang 等针对 p72 蛋白基因建立了 LAMP 结合CRISPR Cas12a 系统的 ASFV 便携式检测方法，检测限可达 7 copies/μL，检测时间只需 30 min；反应结束后可在蓝光（440~485 nm）下肉眼观察到荧光，与临床样本的 qPCR 检测结果具有较好的一致性。Ceruti 等基于 ASFV p72 蛋白编码基因 B646L建立了 RPA 检测方法，该方法只需 42 ℃反应15 min，最低检测限为 3.5 copies/μL，与qPCR 具有较好的一致性。为了节约时间和耗材以及方便基层人员和应急情况下的检测，Wang 等将 RPA与侧流技术相结合，建立了一种用于 ASFV 定点诊断的金纳米颗粒试纸条，称其为侧流基因检测（lateral fl ow gene assay，LFGA）。LFGA 在反应温度较低（37~42 ℃）、反应时间较短（30 min）的条件下，能特异性识别 ASFV 和猪瘟病毒感染血样中的 ASFV，检测限可达 102copies/μL，与琼脂糖凝胶电泳结果相当。LFGA 实现了快速 RPA 扩增后产物的可视化观察，整个过程不需要任何昂贵的仪器，使 ASFV 在有限的环境中实现了点对点诊断。为了克服传统诊断方法耗时长、要求高、不直观等缺点，Fu 等针对 p72 蛋白基因建立 RPACas12a 荧光检测法用于 ASFV 的定点检测，其最低检测限 7 copies/μL，20 min 内即可进行可视化检测。曾宇晨等根据 ASFV B646L、EP402R 基因和多基因家族成员 MGF360/505 基因保守序列，设计特异性的 ERA 探针和引物，建立了 42 ℃等温条件下检测 ASFV 的 ERA 方法，对应基因建立的 3种检测方法分别在 16、7 和 13 min 内即可得出检测结果，检测下限均为 102 copies/μL，特异性强。

用该方法与我国现行 ASF 诊断技术标准中的方法对比，结果符合率为 100%，从而为流行病学调查和现场检测提供了一种快速有效的检测方法。等温扩增方法具有操作简单、不需要昂贵的仪器设备、检测时间短、成本低、携带方便、灵敏度高等特点，可在等温条件下快速进行现场检测，因而为 ASF防控提供了一种快速、直观的检测手段。

3　抗原检测

抗原检测是针对 ASFV 的结构蛋白而建立的一种检测方法。该方法基于抗原抗体反应的基本原理，通过制备针对特定抗原表位的特异性抗体，在体外与病毒蛋白结合形成免疫复合物，从而对样品中 ASFV 的结构蛋白进行检测，能够在发病早期和急性感染的窗口期检测到病毒。目前，抗原检测常用的方法有荧光抗体试验、夹心 ELISA 抗原检测、高敏免疫荧光分析法、免疫层析试纸条等。

3.1 荧光抗体试验

ASFV 荧 光 抗 体 试 验（fl uorescent antibody test，FAT）可用于检测可疑猪组织样品中的病毒抗原。该方法被 OIE 列为 ASF 的辅助诊断方法，用于病毒分离和红细胞吸附试验的补充试验，能够区分 ASFV 和其他病毒产生的细胞病变，及对“非红细胞吸附”ASFV 感染猪进行检测，但 FAT 对荧光素标记的抗原特异性要求较高，非特异性的荧光素染色会造成假阳性结果。此外该方法对亚急性和慢性 ASF 检出率低，仅为 40%，但对早期急性ASF 病例检出率高。该方法操作简单、快速、特异性强，但对人员要求较高，需要荧光显微镜以及必须在相应的生物安全三级及以上实验室进行，不适用于现场检测。

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