非洲猪瘟病原学检测技术研究进展

3.2 夹心 ELISA 抗原检测

夹心 ELISA 是将特异性抗体作为固相包被在 96 孔板中，再加入待检样品及酶标抗体孵育后显色，从而可对样品进行定性或定量的一种方法。我国现行的 ASF 检测标准中是以辣根过氧化物酶标记的 ASFV p30 蛋白单抗作包被抗体，对样品进行检测。而目前已有的商品试剂盒是西班牙 INGEASA 公司的 ASFV 抗原检测 ELISA 试剂盒（DAS-ELISA）。Gallardo 等用该试剂盒对277 份临床样本进行检测，与 qPCR 相比较检测的敏感性为 77.2%。张丽制备了两株 p54 蛋白单克隆抗体，命名为 2E8 和 HRP-6D8，基于这两种单克隆抗体建立了 ASFV 双抗体夹心 ELISA 检测方法。该方法与 DAS-ELISA 试剂盒检测结果符合率为91.8%（134/146）。该方法操作较为简便、快速、成本较低，对仪器设备要求较低，较于抗体检测而言，可以更早地检出 ASFV 感染，适用于对 ASF的高通量检测和早期快速筛查，特别是对于早期急性型 ASF 的诊断敏感性较高。而对于亚急性型和慢性型 ASFV 感染，由于抗原 - 抗体复合物的存在，该方法的特异性及灵敏性稍低，易出现假阳性结果。因此，目前抗原 ELISA 应与 OIE 推荐的诊断技术结合使用，而较早开发一种快速、敏感、特异的ASFV抗原ELISA检测方法对ASF防控极其重要。

3.3　高敏荧光免疫分析法

高敏荧光免疫分析法是一种将独特的镧系元素和免疫学反应结合起来，根据标准浓度曲线对待检样品浓度进行定量检测的新型检测技术。我国现行的 ASF 检测标准是以镧系元素螯合物为荧光信号与抗原抗体免疫层析技术结合起来检测ASFV 抗原。Chen 等利用 Eu3+- 螯合物标记制备的 p30 单克隆抗体建立了一种检测 ASFV 的时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fl uorescence immunoassay，TRFIA），最低检测限为 0.015 ng/mL，检测线性范围为 0.24~500.00 ng/mL，室温下只需45 min 即可得到结果，与农业农村部批准使用的LAMP 同时检测 125 份猪鼻液，两者结果一致。TRFIA 具有较高的敏感性、特异性和准确性，为养猪业快速筛查 ASF 提供了一种新方法。

3.4 胶体金免疫层析试纸条

胶体金免疫层析试验（colloidal gold-based immunochromatographic assay，GICA）是将胶体金标记后的抗待测物抗体的标记物颗粒固定于玻璃纤维上，同时在硝酸纤维素膜上固定特异性抗体和抗抗体，分别作为检测带（test line）和质控带（control line），当试纸条插入检测样品时，抗原与抗体反应导致大量胶体金颗粒的聚集，进而呈现显色反应。为满足基层实验室或屠宰场、养殖场实验室对 ASFV 的检测需求，王之莹等针对 ASFV p72蛋白基因设计一对特异性引物进行 PCR 扩增，并与胶体金试纸条技术结合，建立了一种低成本检测ASFV 的侧流核酸测定试纸条（lateral fl ow nucleicacid assay，LFNAA）。该方法能够在 2 h 内肉眼鉴定出结果，与中国动物疫病预防控制中心认可的 ASFV 检测试剂盒的灵敏度相一致，均能达到103 copies/uL。邬旭龙等针对 ASFV pK205R 蛋白制备了兔抗多克隆抗体，建立了 ASFV 胶体金检测试纸条，其最佳标记量约为 40 μg/mL，T 线捕获抗原的抗体标记最适质量浓度约为 1.5 mg/mL，质控 C 线标记最适质量浓度约为 2 mg/mL，最小检测量为 30~40 ng/mL。该方法操作简便，检测快速，反应条带清晰可见，且具有较高的检测特异性，为临床检测的推广和应用提供了科学依据。Zhang等制备了两株针对 ASFV 磷蛋白 P30 的单克隆抗体，分别命名为 3H7A7 和 6H9A10，并基于这 2株单克隆抗体建立了用于快速检测 ASFV 的胶体金试纸条，检出限为 2.16 ng，检测 153 份临床现场样本（包括血清、血浆、组织和抗凝血处理过的血液），其结果与 qPCR 的一致性为 95.42%，为基层、现场快速筛选可疑感染猪供了一种方便、快捷、简单的检测技术，有利于在现场基层推广使用。

该方法使用方便，操作简单，应用范围广泛，整个检测过程不需要特定的仪器设备与试剂，且结果判定非常直观，因而对基层检测ASFV非常适用。

但是由于胶体金标记物的不稳定性和灵敏度不高，在判定时只能给出定性或者半定量的结果，因此更快研制出新型标记物的免疫层析试纸用于 ASF 基层防控尤为重要。

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