非洲猪瘟病原学检测技术研究进展

2.1 PCR

从发明到现在，PCR 方法被不断改进和优化，已成为实验室病原学检测常用方法之一，也是 OIE推荐的 ASF 诊断方法之一。Agüero 等针对编码p72 蛋白的 B646L 基因保守区域设计了一对特异性引物，建立了 ASFV PCR 检测方法。该方法扩增片段大小为 257 bp，使用的引物是 OIE 推荐使用的引物之一。为了建立一种便捷、快速且精准的ASFV 检测方法，李艳等根据 ASFV p72 蛋白基因序列设计特异性引物，建立了 ASFV 锁核酸修饰引物 PCR 检测方法。该方法具有良好的敏感性和特异性，检测灵敏度可达 3×101copies/μL，比常规 PCR 方法提高了 100 倍，比 qPCR 方法提高了 10 倍。用该方法检测了 72 份临床样品，其结果与 OIE 推荐的 qPCR 方法检测结果一致，符合率为 100%。

因动物疫病的复杂化，ASFV 多与其他病原混合感染，引起的临床症状不典型，无法与其他疫病区别。为了快速诊断猪只感染状况，Liu 等针对 ASFV、猪瘟病毒和非典型猪瘟病毒的高度保守区域设计了 3 对特异性引物，建立多重 PCR 检测方法用于临床样本的鉴别诊断。该方法特异性强、灵敏度高，且对样品保存方式要求较低，但对技术人员操作要求高，不适于现场检测。

2.2 qPCR

相比于普通 PCR，qPCR 在普通 PCR 基础上引入了光谱技术，通过荧光信号的强弱变化，定量实时监测 PCR 反应的整个过程，最后通过扩增曲线和反应特异性扩增产物的量（Ct）来判断样品的阴阳性。该方法的特异性、灵敏性都超过普通PCR，且自动化程度高，不易污染，是目前公认的金标准之一。

为了防止基因错配而导致检测不准确，Yang等针对 B646L 和 B438L 基因的保守区设计了 2组特异性引物和 2 个 TaqMan 荧光探针建立了双重qPCR。该方法的检测限为 10 copies/μL。用 180 份ASFV 临床感染样本，将其与商品化试剂盒进行检测比较，结果两种方法具有良好的一致性（98.3%），因而该方法可以极大提高 ASFV 检测效率。为了鉴别检测 ASFV 的野生型毒株和基因缺失毒株，韩勇军等根据 ASFV 的 P72、CD2v、MGF360-14L 基因保守序列设计了特异性引物和探针，建立了一种可以同时检测上述 4 种基因的多重荧光定量PCR 方法。该方法的最低检测限为 100 copies/mL。

用该方法与 ASFV 核酸检测试剂盒对 35 份临床样品进行检测，结果阳性符合率为 100%。该方法的建立对 ASFV 的鉴别检测、病原流行病学调查等具有重要意义。为了快速检测出越南 ASFV 流行毒株，Trinh 等针对编码 p54 蛋白的 E183L 基因建立一种新型 qPCR 方法。该方法检测限为2.63 copies/μL，能够检测根据 P72 基因分型的 I、II 和 V 的 15 种不同 ASFV 参考毒株，为 ASF 防控提供了一种新的检测方法。

qPCR 检测技术灵敏，极其微量的污染即可造成假阳性，所以对于 PCR 实验室，应根据条件实施试剂准备区、样本制备区、产物扩增区等分区管理，同时也要注意由于引物和探针的错配及选择的试剂盒不够敏感等原因导致的假阴性结果，所以一次检测的阳性和阴性结果均需谨慎评价，最终确诊需结合临床和流行病学指标，必要时可采取基因测序或者其他平行试验。

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