非洲猪瘟诊断技术研究进展（二）

1.2.8 交叉引物扩增技术（cross priming amplifi cation，CPA）　CPA 是一类等温核酸扩增反应，利用交叉引物和探针，能够在 1 h 内扩增出至少 4 个拷贝的基因组 DNA，具有高度特异性。CPA 方法依赖于具有链置换活性的 DNA 聚合酶，通过链置换进行核酸扩增。该技术是我国首个具 有自主知识产权的核酸扩增技术。Frączyk 等基于 P72 基因，设计了一组 CPA 引物，可以特异性检测猪和野猪血液、血清样本中的 ASFV DNA以及 CSFV DNA，无需提取 DNA，无交叉反应性，检测灵敏度与 qPCR 一致。CPA 高度敏感，可在水 浴中进行，无需使用热循环器。这种快速检测技术为储存、运输和销毁怀疑感染 ASFV 病毒的材料提供了更好的生物安全措施。

1.2.9　 原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）　ISH 就是将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，目前已发展出荧光原位杂交技术（FISH）以及多彩色荧光原位杂交技术（mFISH）。FISH 克服了放射性探针检测周期长且危害人体健 康的缺点，被广泛应用于基因定位、染色体识别等研究中。Bentolila 等进行了小鼠的量子点荧光原位杂交（QD-FISH），发现 QD-FISH 探针可穿透完整的间期细胞核和中期染色体，并显示出对致密染色质结构域的良好靶向，且空间位阻最小， 表明 QD-FISH 探针在 QD-FISH 应用中十分有效。

Ballester[26] 开发了一种新 ISH 法，使用地高辛标记探针，来鉴定用福尔马林固定、石蜡包埋组织中的ASFV 基因组，检测效果良好。

1.2.10　生物传感器技术　该方法通过生物识别元件识别分析物，然后换能器将生物识别元件捕获目标分析物后发生的反应转换成等效信号，最后由检测器系统将信号进行处理和分析，从而得到分析结果。Biagetti 等利用 DNA/LNA 探针 作为 ASFV VP72 基因保守区的互补识别元件，建立了一种基于生物传感器的方法来检测猪血液中的 ASFV。其检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为 178 拷贝 /μL 和 245 拷贝 /μL，该结果和 OIE推荐的 qPCR 敏感性相当。该方法可用于 ASF 的 初步诊断及筛检，具有快速、简便、成本低的优点。Wu 等将 PCR、Cas12a 和侧流生物传感器（LFB）结合起来，基于 Cas12a 的生物传感器靶向不同 ASFV 菌株中 VP73 基因的保守区域，同时检测 7 种不同基因型的 ASFV 病毒。该方法具有 极高特异性和灵敏性，而 操作简便、价格低，可以普遍用于检测 ASFV 和其他病毒。

2　血清学检测

2.1 抗体检测

2.1.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）　ELISA 是目前血清检测最常用的方法，也是 OIE 指定的ASF 首选血清学诊断方法。ELISA 的敏感性、特异性都较高，操作方便快速，适用于检测多头猪样本，能够快速检测群体中的 ASFV 抗体。但是，当检测样品发生降解或在 -20 ℃放置太长时间时，ELISA 检测的灵敏度就会降低。目前，常用作检 测 ASFV 抗原的蛋白有 p30、p54、p72、pp62 等。Gallardo 等通过使用杆状病毒表达 p30、p54 和pp62 重组蛋白建立的重组 ELISA 检测方法，不仅显示出比 OIE 推荐方法（ELISA）更高的灵敏度，而 还减少了检测出假阳性的概率，极大程度提高了检测的准确性。Giménez-lirola等基于多重荧光微珠的免疫测定法（FMIA）对 ASFV 的 3 种重组多肽（p30、p54、p72）感染猪后产生的早期血清抗体进行比较，以选择最佳候选抗原，结果发现p30 是早期诊断的最佳抗原；通过表达 ASFV p30蛋白，开发了一种能够检测血清或口腔液标本中ASFV 抗体的间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA），其对两种样本类型都具有高度特异性，而且在 8DPI 时，就可以检测到口腔液抗体，与 OIE 推荐的I-ELISA 敏感度相当。

2.1.2　间接荧光抗体试验（indirect fl uorescent anti-body test，IFA）　IFA 是一种免疫标记技术，应用荧光标记的二抗，通过与抗原抗体复合物中的抗体结合而检测未知抗原。Heimerman 等通过对 ASFV 感染的 Vero 细胞进行免疫荧光抗体（IFA） 染色，共回收了 29 种单克隆抗体（mAb），并对其中的 IFA 阳性抗体进行进一步表征，发现这些抗体均位于 p72 的高度保守区域内，这为开发新的ASFV 抗体和抗原检测方法提供了机会。Wu 等开发了一组针对 ASFV p30 的 mAb，并对其中的14 种进行检测，通过 IFA 等方法检测发现，这些抗原区域 3 和 4 在宿主抗体反应中高度保守并具有 免疫优势，从而为 ASF 血清学检测的开发和改进提供了有价值的工具。

2.1.3 胶体金快速免疫层析法（gold immunochromatography assay，GICA）　GICA 是一种以胶体金标记的抗原或抗体作为示踪标志物，以纤维素膜用作载体的免疫标记技术。吴海涛等以硝酸纤维素（NC）膜上分别包被的 ASFV p72多克隆抗体和 SPA 作为检测线和质控线，制备了 用于检测 ASFV 的胶体金免疫试纸条。该试纸条在 10 min 内就可以检测出阳性抗原，敏感性和特异性良好，而 具有高度稳定性，在 ASFV 临床检测中有良好的应用前景。

2.1.4 免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）　IBT 通过 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳区分待测样品不同组分，在电流作用下，使蛋白质从凝胶转移至固相载体（膜）上，通过特异性抗体作为 探针，对靶抗原蛋白质进行检测分析。Alcaraz 等在大肠杆菌中表达重组蛋白 p54，首次建立了ASFV 重组蛋白的 IBT 法。该法对检测感染猪的ASFV 具有高度的特异性和敏感性，而 消除了因抗原中含有细胞蛋白从而产生的假阳性，并避免了 在抗原生产中使用活病毒。

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