非洲猪瘟诊断技术研究进展（二）

1.2.2　实时荧光定量 PCR（quantitative real-timePCR，qPCR）　qPCR 是通过对体系中加入的荧光基团产生的信号进行实时收集积累，最后用标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与基于凝胶的常规 PCR 方法相比，qPCR 方法具有快速、灵敏度高、不易交叉污染，以及可以定量分析的优点，现已成为病原学诊断中应用最广泛的方法。King等首次根据 ASFV 的 VP72 基因设计特异性引物和探针，建立了一种 TaqMan qPCR 来快速检测ASFV DNA，灵敏度在 10~100 个分子之间，并针 对不同地区 25 株代表 9 个基因型（I、III、IV、 V、VI、VII、VIII、IX、X）的 ASFV 分离株和 16个非洲、欧洲蜱分离株进行了验证，结果没有发现与相关的猪病毒发生交叉反应。Zsak 等也基于VP72 基因建立了一种实时 TaqMan PCR 方法，可以通过使用便携式检测仪器实时获得检测结果，从而简化聚合酶链反应操作程序。该方法比 OIE 推 荐的常规 PCR 和 qPCR 具有更高的灵敏度。现已成为病原学诊断中应用最广泛的方法。

1.2.3　多重 PCR（multiplex polymerase chain reaction，mPCR）　多重 PCR 是在常规 PCR 的基础上进行改进的，在本身体系结构中增添更多的引物来进行扩增，因目标片段之间有着较大的差异性，所以通过凝胶成像能直接进行分析，是一种应用范围更广、更加有效的 PCR 新技术。Giammarioli 等基于猪瘟病毒（CSFV）、ASFV、猪圆环病毒 2 型 （PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪细小病毒（PPV）基因组设计特异性引物，开发了一种新的热启动 mPCR 方法，可同时检测猪的多种病毒感染。

1.2.4 微滴数字 PCR（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）　ddPCR 是 第三代 PCR技术，可以在不使用标准样品的情况下绝对定量核酸。它先对样品进行微滴化处理，然后经 PCR 扩 增，再对每个微滴进行检测，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度。该方法更精确、更数字化，灵敏度更高。Wu 等基于 ASFV K205R 基因的高度保守区域设计特异性引物和 TaqMan 探针，建立了一种准确、灵敏的 ASFV ddPCR 检测方法。ddPCR 的最小检 测限约为 10 拷贝 / 反应，而 qPCR 的检测限为 102拷贝 / 反应，因此 ddPCR 的检测灵敏度是 qPCR 的10 倍。

1.2.5 巢氏 PCR（nested-PCR）　巢式 PCR 涉及两组引物，用于连续两次的聚合酶链反应，第二组引物用于扩增第一批产物中的第二个靶标，一般 适用于一些有必要增加灵敏度和 / 或特异性的 PCR反应。Basto 等首次建立了一种带有内部对照 的巢式 PCR 检测方法，用于检测不同蜱种中的ASFV DNA。检测蜱类中的 ASFV 感染状态，有助于确定该地区有无 ASFV 感染。

1.2.6　 环介导等温扩增技术（loop mediatedisothermal amplifi cation，LAMP）　LAMP 是 用于 DNA 扩增的单管技术，使用两套或三套引物和一种具有复制活性、高链置换活性的聚合酶，可在 15~60 min，60~65 ℃的恒定温度下扩增靶序列，是一种更简便、快速、精确，且成本低的 扩增方法。Wang 等设计了针对 ASFV P10 基因的 LAMP 引物，并用伪狂犬病病毒（PRV）、PCV2、CSFV、PRRSV、PPV 和 ASFV 的 DNA 或cDNA 验证实时 LAMP 和可视化检测的特异性，证实 LAMP 可以准确和特异性检测 ASFV。Zhu 等通过将 Hive-Chip 和 LAMP 相结合，设计针对 5 个ASFV 基 因（B646L、B962L、C717R、D1133L 和G1340L）的 LAMP 引物，并将其预固定在 HiveChip 中，结果发现靶基因之间没有交叉反应。该方法无需核酸提取，不依赖精密仪器，可避免因病毒的单个基因突变引起的假阴性问题，且灵敏度高、特异性强，检测结果可视化。Wang 等根据 ASFV P72 基因高度保守区域设计引物，建立以中性红为显色指示剂的视觉 LAMP 检测方法，其特异性高，不与其他猪病毒出现交叉反应，与 OIE推荐的 qPCR 方法敏感度相当。

1.2.7 重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplifi cation，RPA）　RPA 技术是由Piepenburg 等在 2006 年建立的一种等温核酸扩增技术。该技术不需要模板的热变性，反应温度为37~42 ℃，扩增反应时间一般为 10~20 min。Miao等开发了一种将 ASFV P72 基因的 RPA 与侧 流检测（LFD）相结合的快速检测方法。RPALFD 法对 ASFV 具有高度灵敏性和特异性，并且与 CSFV 等其他猪病毒没有交叉反应。哈登楚日亚等建立了 ASFV 实时荧光 RPA 检测方法。该方法在 39 ℃，20 min 内可检测 10 个拷贝的 DNA 分子，并且与 CSFV、PCV2、PPV、PRV 都无交叉反应，可用于 ASFV 的定性检测。Wang 等也 将 RPA 与 LFD 相结合，开发了一种用于 ASFV 现 场诊断的金纳米颗粒试纸条，称为侧向流动基因检测（lateral fl ow gene assay，LFGA）。该方法使用尾部引物来产生一端具有单链尾部的双链体。该双链体与金纳米粒子（AuNP）标记的探针杂交，使标记在检测探针上的金纳米粒子在试纸条的测试线上显示红色带，即为阳性。在较低的反应温度和较短的反应时间下，LFGA 可以特异性区分 ASFV 和CSFV，检测限为 102 拷贝 /μL，灵敏度与琼脂糖凝胶电泳相当，整个操作过程不需要任何昂贵的仪器，并且快速、特异、操作简单，对 ASFV 的早期诊断非常有帮助。目前，随着 CRISPR/Cas 技术的不断发展，已经有研究将 RPA 和 CRISPR/Cas12a相结合来实现更高的灵敏度，并提供了对条带的高灵敏度荧光检测。这在实现多基因检测的同时，为更灵敏、更快速的 ASFV 诊断提供了启示。

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