动物源性食品中细菌的检测——金黄色葡萄球菌

  培养：将接种样液的测试片的透明面朝上水平置于培养箱内，堆叠片数不超过20片，在（36±1℃条件下培养（24±2）h。

  确认反应：如果测试片上没有菌落生长或菌落全部是紫红色（典型的金黄色葡萄球菌特征），无须进行确认；如果测试片上出现黑色、蓝绿色菌落或紫红色菌落不明显，需使用PetrifilmTM确认反应片做进一步确认。

  将上层膜掀起，将确认反应片置入测试片的培养范围内，再将上层膜放下覆盖在确认反应片上，用手指滑动的方式轻轻将测试片与确认反应片压紧，包括确认反应片的边缘，此步骤可使测试片与PetrifilmTM确认反应片紧密接触并除去气泡，最后把插入确认反应片的测试片放在（36±1）℃条件下培养1～3h。

  结果计算与报告：紫红色的菌落直接计数为金黄色葡萄球菌；需要使用确认反应片做确认时，计数有粉红色晕圈的菌落。没有粉红色晕圈的菌落不是金黄色葡萄球菌，不应被计数。如果整个培养面呈粉红色而没有明显的晕圈，说明金黄色葡萄球菌大量存在，结果记录为“多不可计”。

  菌落计数。培养结束后立即计数，可目视或用菌落计数器来计数，放大镜可辅助计数；选取金黄色葡萄球菌菌落数在15～150个的测试片，计数菌落数，乘以相对应的稀释倍数报告之；如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15个，则计数稀释度最低的测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告之；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之；如果最高稀释度的菌落数大于150个，计数最高稀释度的测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告之。报告单位以CFU/g（mL）表示。

  4.3 ELISA方法检验金黄色葡萄球菌肠毒素

  （1）原理 本方法可用A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型ELISA检测试剂盒完成。本方法测定的基础是ELISA。96孔酶标板的每一个微孔条的A～E孔分别包被了A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素抗体，H孔为阳性质控，已包被混合型金黄色葡萄球菌肠毒素抗体，F和G孔为阴性质控，包被了非免疫动物的抗体。样品中如果有金黄色葡萄球菌肠毒素，游离的金黄色葡萄球菌肠毒素则与各微孔中包被的特定抗体结合，形成抗原抗体复合物，其余未结合的成分在洗板过程中被洗掉；抗原抗体复合物再与过氧化物酶标记物（二抗）结合，未结合上的酶标记物在洗板过程中被洗掉；加入酶底物和显色剂并孵育，酶标记物上的酶催化底物分解，使无色的显色剂变为蓝色；加入反应终止液可使颜色由蓝变黄，并终止了酶反应；以450nm波长的酶标仪测量微孔溶液的吸光度值，样品中的金黄色葡萄球菌肠毒素与吸光度值成正比。

  （2）仪器和设备 冰箱、恒温培养箱、振荡培养箱或普通培养箱、电子天平（0.01g）、均质器、离心机、离心管（50mL）、滤器（0.2μm）、微量加样器、微量多通道加样器、自动洗板机（可选择使用）、酶标仪。

  （3）试剂和材料 A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型ELISA检测试剂盒，pH试纸（3.5～8.0），025mol/L的三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（pH8.0），磷酸盐缓冲液（pH7.4），庚烷，10%次氯酸钠溶液，肠毒素产毒培养基，营养琼脂。

  （4）检测步骤

  从分离菌株培养物中检测金黄色葡萄球菌肠毒素方法：将待测菌株接种营养琼脂斜面（试管18mm×18mm），于37℃培养24h，用5mL生理盐水洗下菌落，倾入60mL产毒培养基中，37℃振荡培养48h，振速为100次/min，吸出菌液离心，8000r/min离心20min，100℃加热10min，取上清液，取100L稀释后的样液进行试验。

  从食品中提取和检测葡萄球菌毒素方法：对于乳和乳粉样品，可将25g乳粉溶解到125mL0.25mol/L的Tris缓冲液（pH8.0）中，混匀后同液体乳一样按以下步骤制备。将乳于15℃下3500g离心10min。将表面形成的一层脂肪层移走，变成脱脂乳。用蒸馏水对其进行稀释（1∶20）。取100μL稀释后的样液进行试验。

  对于脂肪含量不超过40%的食品，称取10g样品绞碎，加入pH7.4的PBS液15mL进行均质。振摇15min。于15℃下3500g离心10min。必要时，移去上面脂肪层。取上清液进行过滤除菌。取100μL的滤出液进行试验。

  对于脂肪含量超过40%的食品，称取10g样品绞碎，加入pH7.4的PBS液15mL进行均质。振摇15min。于15℃下3500g离心10min。吸取5mL上层悬浮液，转移到另外一个离心管中，再加入5mL的庚烷，充分混匀5min。于15℃下3500g离心5min。将上部有机相（庚烷层）全部弃去，注意该过程中不要残留庚烷。将下部水相层进行过滤除菌。取100μL的滤出液进行试验。

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