塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增技术（RPA）实时荧光检测方法的建立

摘要 ：塞尼卡谷病毒（Seneca valley virus，SVV）可感染猪，引起类似口蹄疫病毒感染造成的水疱性病变，新生仔猪病死率达 30%~70%。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术（RPA），针对 SVV 3D 基因设计了引物和探针，并进行筛选、反应条件优化以及敏感性、特异性和重复性试验，建立了实时荧光 RPA 方法。结果显示，本方法在 40 ℃、10 min 内检测的最低浓度为 28 拷贝 /µL ；与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应 ；通过 3 次重复试验检测 2.8×106~2.8×101 拷贝 /μL 的 6 个稀释度样品，在荧光强度达 1 500 mV 所需时间变异系数范围在 2.44%~14.95%。该等温、快速扩增方法为猪群出现水疱性疾病的鉴别诊断提供了技术支持，对及时采取适当防控措施具有重要意义。

塞尼卡谷病毒（Seneca Valley virus，SVV），又称为 Senecavirus A（SVA），是猪原发性疱疹病（Swine idiopathic vesicular disease，SIVD）的主要病原。SVV 感染猪群后，尽管不会造成与口蹄疫病毒相同的较大政治、经济损失，但所引起的水疱性病变，与口蹄疫、猪水泡病、水泡性口炎、猪水疱疹等造成的病变相似，给临床鉴别诊断造成了一定的困难。目前，北美、南美地区以及澳大利亚都有猪群发生 SIVD 的报道。我国于 2016 年也首次分离到了 SVV。目前，国内外已经开发了RT-PCR、荧光定量 PCR、ELISA 等 SVV 实验室诊断方法，但上述方法操作繁琐，需依赖昂贵的仪器，且耗时较长（2 h 以上）。本研究采用的重组酶聚合酶等温扩增技术（Recombinase polymeraseamplification，RPA）是近年来出现的恒温、核酸快速扩增技术，已广泛用于病毒、细菌、寄生虫诊断研究 。在扩增反应中，重组酶首先与上下游引物结合，寻找、定位同源的双链 DNA，进行链交换；聚合酶从上下游引物的 3´ 端启动模板合成，形成两条双链 DNA。该方法在 37~42 ℃，10~30 min，对核酸进行特异性扩增，最低可检测 1~1 000 个拷贝的 DNA 或 RNA 分子。RPA 结果读取方式多样，可采用琼脂糖凝胶电泳、实时荧光、侧流层析试纸条的方式，如已成功建立了犬细小病毒 2 型 RPA琼脂糖凝胶电泳检测方法、中东呼吸综合征冠状病毒 RPA 实时荧光方法、贾第鞭毛虫 RPA 侧流层析试纸条检测方法。目前国际上尚无采用实时荧光 RPA 检测 SVV 的报道。本研究建立了实时荧光RPA 检测方法，为 SVV 快速诊断及防控提供了技术参考。

1　材料与方法

1.1 毒株及核酸

口蹄疫病毒 O 型缅甸 98 株（FMDV）cDNA、 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）CH-1R 株 cDNA、猪瘟病毒 C 株（CSFV）cDNA、猪流行性腹泻病毒（PEDV）CV777 株和猪传染性胃肠炎病毒华毒株（TGEV）cDNA，由本实验室保存。

1.2 实时荧光 RPA 标准品的制备

根 据 NCBI 中登录的 SVV 全基因序列（NC_011349.1），合成基因共 7.31 kb。全基因由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。选择 BamH I 和 EcoR I 酶切位点，将目的基因克隆于 pUC19 载体中构建重组质粒 pUC19-SVV，载体为 pUC19，重组质粒浓度为 300 ng/μL，约为2.8×1010 拷贝数，作为实时荧光 RPA 标准品。

1.3　主要仪器和试剂

实时荧光 RPA 监测仪器 TwistaTM，购自TwistDX 公 司；2×Probe qPCR Mix 试剂盒， 购自 Takara 公 司；Twist Amp exo 试剂盒， 购自TwistDX 公司。

1.4　引物和探针设计

根据 NCBI 中登录的 SVV 3D 基因序列（NC_011349.1），分别使用 Primer 5.0 软件设计3 组引物和探针，分别为：组合 1（P-1），包括F1、R1、Pb1；组合 2（P-2）， 包括 F2、R2a、Pb2；组合 3（P-3），包括 F2、R2b、Pb2（表 1）。将探针和引物进一步通过 NCBI 的 BLAST 进行序列比对分析，比较设计的探针和引物序列与主要 猪 病 病 毒（FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV）的序列匹配度，确定引物和探针的特异性，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

首页前一页12345后一页尾页