2017年H5亚型禽流感流行毒株变异情况研究及分析

摘要：H5亚型禽流感2.3.4.4分支病毒已流行了几年，当前的流行毒株是否会因变异而导致免疫失败引起关注。本研究对近年来流行毒株进行测序，比较分析了其抗原位点的变异情况，结果发现2017年的流行毒株已发生较大的变异，形成了一个独立的分支，与其之前的毒株HA核苷酸序列的差异达4.4%-5.4%。其最大特征是HA蛋白的142位E（按A/Goose/Guangdong/1/96毒株排序）发生缺失，导致该处增加了1个糖基化位点；同时受体结合位点的口袋右缘发生L145S的变异，而这一位点变异时间在2016年的毒株就已产生；2017的毒株另有12个aa发生了较为一致的变异。故推测当前毒株的抗原性已发生了较大变化。但238位（H3排序226位）匀为Q，保持禽源毒株的特征。需采取增加疫苗免疫频次及剂量，强化生物安全措施加以防控。

H5亚型离流感自1996年发现以来已流行了20多年，给养禽业造成了巨大的损失，同时对公共卫生构成了严重威胁。病毒在这其间发生了多次的变异，产生了0-9分支，共10个不同分支的毒株。每间隔3-4年H5亚型流感病毒发生1次新的优势流行毒株的更叠，疫苗也随之不断更换。当前流行毒株主要为2.3.4.4分支，与其相对应的疫苗为Re-8疫苗，该分支毒株由2008年出现的2.3.4分支进化而来，2014年在韩国、越南等国流行以来, 已有几年，近期生产上也有免疫失败情况增多的反映，当前流行毒株是否发生了变异，引起特别关注。本研究选取日常监测中发现的阳性样测序结果进行分析，旨在了解当前毒株的变异情况，指导生产与防控工作。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品：拭子样品8份，不同年份的采集于活禽交易市场。

1.1.2 试剂：抽提试剂RNAiso Reagent、一步法RT-PCR扩增试剂（PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit ），购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 HA基因的扩增引物：上游引物P1：5`-CAGGGAGCAAAAGCAGGGGTYCAAT-3`；下游引物P2：5`- GGTGGATTCTCTGTCTGCAGCGTAC-3`，P3: 5`-CTACTAGATCCCAAGTAAACGGGCAAC-3`；下游引物P4：5`-AGAAACAAGGGTGTTTTTAAYTACAAT-3`，上海立菲生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取：按抽提试剂操作说明书进行。

1.2.2 HA基因扩增体系与程序：上、下游引物(25μM)各1μL、2×Bμffer 25μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μL 、DEPC水11μL和所提取的病毒RNA 10μL，体系共50μL，反应程序为50℃ 30min，95℃ 2min，然后95℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 2min，30个循环，72℃延伸8min。

1.2.3 序列测定和分析

将PCR产物送上海立菲生物工程有限公司进行测序，结果用DNAstar软件进行序列拼接。并与下载自GenBank 的禽流感病毒祖先代表株A/goose/donguan//2017/H5的HA基因组序列进行比较, 采用MEGA 5.0软件绘制其HA因组的系统进化树。

2、结果与分析

2.1 HA 基因扩增结果

扩增出大小分别为1191bp和1057bp的特异性条带，与设计预期相符。见图1。

图1  PCR扩增结果

M、DNA Marker DL2000；1-8、P1P2扩增结果；9-16、P3P4扩增结果

2.2 HA基因遗传进化分析

将2017年的毒株A/goose/donguan//2017/H5，通过与Genbank上收录的序列进行比较，结果相似性最高的为KY415645(A/chicken/Ganzhou/GZ21/2015/H5N6)，二者核苷酸的相似性为98%。从进化树可以看出近年毒株可分为2个分支。其中2017年的3个株毒已形成一个独立的分支；2013-2016年形成另一个分支，该分支各毒株间也有一定的差异，但不同年份毒株的差异不具有时间规律性。与最早出现的高致性H5代表株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)相比有较大的差异，见图2。当前最新的2017年毒株与A/Goose/Guangdong/1/96相比，核苷酸差异已达10.1%-10.2%，与2016年毒株相比差异性为4.2%-4.8%，与2015年毒株相比差异性为5.1%-5.4%，与2014年之前的毒株相比差异性为4.4%-4.5%。2017年3个毒株间的差异较小，仅为0.4%-0.7%。2016年以前的毒株间的差异相对较小，2.1%-3.8%。

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