兽药残留分析技术

2　测定方法

2. 1　气相色谱法

气相色谱法有许多高灵敏、通用性或专一性强的检测器供选用,如氢焰离子化检测器( FID) 、氮磷检测器(NPD)等,检测限一般为μg/kg级。但是大多数兽药极性或沸点偏高,需繁琐的衍生化步骤,限制了GC的应用。所以, 20 世纪80 年代后HPLC的发展速度超过GC,相当数量的兽药采用或改用HPLC进行分析,如氯霉素、磺胺类药物等。

2. 2　高效液相色谱法

几乎所有的化合物包括高极性/离子型待测物和大分子物质均可用HPLC进行测定。HPLC的分离机制与常规柱色谱相同,但填料更加精细(Φ5～10μm) ,可重复进样,分析速度快。HPLC至今仍缺乏可满足兽药残留分析要求的通用型检测器。紫外检测器(UVD)最普及,其次是荧光检测器和电化学检测器。光二极管阵列检测器是近十年来HPLC最重要的突破。DAD可同时接收整个光谱区的信息,在色谱峰流出同时能进行每个瞬间的动态光谱扫描并快速采集信号,经计算机处理后得到色谱- 光谱的三维图谱,信息量大大增加。一次进样可得到每个组分峰的定量、定性和纯度信息, 灵敏度亦明显提高。大部分抗生素在高于230 nm的光谱区无吸收,而在低于230 nm的紫外区许多样本基质和流动相产生干扰,需衍生化后测定,限制了紫外检测器的应用。旋光检测有以下特点:(1)选择性高,样本仅需简单提取即可; (2)灵敏度高,利用He- Ne激光作光源,灵敏度可达5～10μg水平; (3)可同时得到流出组分的比旋度,用以定性。目前,该方法已用于红霉素、庆大霉素、羧苄青霉素和吩羧青霉素残留的测定。

2. 3　高效薄层色谱(HPTLC)

HPTLC的出现使TLC进入了复兴时期,现已成为仅次于HPLC和GC的残留分析方法。HPTLC的斑点原位扫描定量、定性和高效分离材料(Φ3～10μm) 。改变了常规TLC在灵敏度和重现性方面的不足,但保持了TLC的简便、快速和样品容量大的优点,可使用正相或反相板,分辨率几乎与HPLC相当。HPTLC在兽药残留的快速筛选性检测方面应用广泛。

2. 4　超临界流体色谱( SFC)

SFC可弥补GC和HPLC的不足,但不可能取代二者。SFC最大优点是可以方便地连接各种灵敏的检测器(MS, ECD等) ,如猪组织中磺胺类药物等抗菌素残留的SFC -MS分析。

2. 5　毛细管区域电泳(CZE)

CZE是20世纪90 年代以来研究最活跃的分析技术之一。1989年开始有商品出售。CZE不同于传统的凝胶电泳技术, CZE使用直径仅25～50μm的毛细管而不用载体,待测组分在高压(20～30 kV)下泳动,截面积小,热量和泳速均匀。所以, CZE兼有高压电泳的高速、高分辨和HPLC灵活、高效的优点,柱效高达106塔板/m。向电解质中加入超临界胶束浓度的表面活性剂,如十二烷基硫酸钠( SDS) ,即为毛细管胶束电动色谱( cap illarymi - cellarelectrokineticchromatography,CMEC) ,分离范围可扩展至中性或两性分子,分离效能亦进一步提高。CZE将在简化样本前处理、多残留分析和分析自动化方面发挥重要作用。目前CZE的主要问题是样品量太小,限制了检测的灵敏度。CZE - MS可能是最好的解决办法。

2. 6　联用技术

各种分析技术联用是现代兽药残留分析乃至整个分析化学方法上的发展特点。计算机的应用加速了这一趋势。联用技术可扬长避短,一般兼分离、定量和定性(分子结构信息)于一体,因而特别适用于确证性分析。常见的联用技术,如TLC- MS、GC - MS、LC - MS、CZE - MS、LC - NMR、SFC - MS等。

TLC - MS是最简单的离线联用技术。GC - MS已相当成熟,应用相对较多。但这些联用仪价格昂贵,远不如HPLC或GC那样普及。MS无疑可作为HPLC的通用型检测器。使用微型柱(15 ×0. 3 cmid)和适宜的接口技术,如热喷雾( TSP) 、微粒束( PB)等解决了LC与MS的连接问题;使用软电离技术,如快原子轰击( FAB) 、场解吸( FD)等解决了难气化物质的离子化问题。LC - MS现在已进入实用阶段,其灵敏度较荧光检测器高1个数量级,能方便地对ng级的兽药残留组分进行检测与结构确证。

2. 7　残留分析的智能化

残留分析对象的日益复杂和样品数量的增加使分析过程对计算机的依赖愈来愈大,主要表现: (1)检索系统,如建立待测物的GC或HPLC数据库; (2)专家系统,如分析条件优化和数据处理; (3)操作过程自动化,如国外已经出现的实验室机器人。

3　免疫分析技术

免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的新型分析技术。兽药残留免疫分析方法的建立步骤包括待测物选择、半抗原及人工抗原的合成、抗体制备和测定方法建立。其质量控制原则应与常规理化分析技术一致。免疫反应具有极高的选择性和灵敏性,因此,免疫分析技术无论作为兽药残留分析的检测手段还是样本净化方法,都能使分析过程特别是前处理步骤大大简化。目前几乎所有重要的兽药已建立或试图建立免疫测定法(多数是EL ISA)  ,如青霉素、链霉素、四环素、氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶、莫能菌素、盐霉素、阿维菌素等。将免疫分析与理化分析技术联用,其中较重要的是抗体介导的净化技术,典型代表是免疫亲合色谱。将免疫亲合色谱作为理化测定技术的净化手段,可使兽药残留分析将免疫技术的高选择性和理化技术的快速分离和灵敏性融为一体。IAC - HPLC或IAC - GC是常见的联用方式,如氯霉素、乙烯雌酚、甲基睾酮/去甲睾酮、阿维菌素、依维菌素等残留的分析。

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