单碱基编辑技术及其在动物育种中的应用研究进展

1.2.2 碱基编辑窗口的优化

不同类型的碱基编辑系统的编辑窗口不同，在实际研究应用中，也需要对编辑活性窗口做出相应的改动。当碱基编辑器被用于精准改变某个特定的碱基时，过大的脱氨化窗口会导致窗口内非靶标碱基的编辑。由于CBE只能对胞嘧啶脱氨酶活性位点附近的C脱氨基，而胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1的活性窗口通常有5个核苷酸，会使活性窗口中非靶向的碱基也发生替换作用从而发生脱靶，Kim等对胞嘧啶脱氨酶进行突变，在降低酶的活性的同时，通过改变底物的结合和构象直接降低底物进入胞嘧啶脱氨酶活性区域的能力，将单碱基编辑系统的活性窗口5个核苷酸缩小至1~2个核苷酸。

然而，当碱基编辑系统被用于筛选功能基因、进行可变剪接、编辑调控元件等时，较大的编辑活性窗口更有利于研究。Zhang等将10个非序列特异性的ssDNA结合结构域（ssDBD） 与CBE 进行融合，筛选发现将Rad51蛋白的ssDBD 融合到APOBEC1 与Cas9n之间能够显著提高碱基编辑活性，同时大幅扩大编辑窗口。此外，CP1012-ABEmax、CP1028-ABEmax、CP1041-ABEmax和CP1249-ABEmax碱基编辑器在保证效率与ABEmax相当的情况下，可将 4~8位的碱基编辑窗口拓展为4~12位。

1.2.3 碱基编辑范围的优化

常用的碱基编辑器大部分都与化脓性链球菌的Cas9（SpCas9）蛋白进行融合使用，只能靶向含有NGG或NGA序列的PAM位点，限制了其在基因组中的靶向范围。因此，研究人员将SpCas9替换为其他Cas蛋白， 通过不同Cas蛋白识别不同PAM，进而扩大碱基编辑系统在基因组中的编辑覆盖度。Kim等使用金黄色葡萄球菌的Cas9（SaCas9）、SaCas9突变体（Sacas9-KKH）、SpCas9突变体（SpCas9-VQR、SpCas9-EQR、SpCas9-VRER）替代SpCas9，识别含有NGG、NGA、NGAN、NGAG、NGGG、NNGRRT和NNNRRT的PAM 序列，显著扩大了单碱基基因编辑的靶向范围；此外，通过dCpf1和Sp-macCas9的融合，科研人员突破CBE之前只能识别富含GC序列的PAM位点的限制，使识别范围拓宽至富含AT序列的PAM位点。

1.2.4 碱基编辑脱靶问题的优化

碱基编辑在应用中的脱靶效应会造成无法预计的后果，为了更安全地利用碱基编辑技术，寻找一种科学快速的脱靶检测手段势在必行。2020年，中国科学家建立了一种名为GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryoInjection）的新型脱靶检测技术，它提高了基因编辑技术脱靶检测的敏感性，可以在不借助于任何脱靶位点预测技术的情况下发现之前的脱靶检测手段无法发现的完全随机的脱靶位点，为碱基编辑的脱靶研究提供了新的方法。其次，gRNA特异性的改良对于脱靶问题的解决也具有重要意义，如在一定范围内适当调整gRNA长度也能降低脱靶效应；调整gRNA 上游5'的发夹结构可提高Cas9和Cas12的特异性，并将脱靶效应降低55倍。此外，Cas9蛋白的改造也是降低脱靶效应的手段。SpCas9-HF（经过设计的高保真SpCas9变种）在人体细胞基因编辑中表现出超常的准确性，同时，只表现出微量的脱靶效应；对于人类细胞基因组编辑，特异性增强的eSpCas9（K848A、K1003A、R1060A）可减少非目标链结合，从而增强基因编辑的特异性。

2 单碱基技术在动物育种中的应用

2017年， Kim等通过BE3编辑小鼠胚胎Tyr基因和Dmd基因，建立了小鼠白化病和肌营养不良疾病模型；Zhang等通过编辑斑马鱼胚胎的Tyr 基因建立了模拟人类眼白化病的疾病模型；松阳洲实验室利用HF2-BE2高效编辑小鼠Tyr基因，建立了小鼠白化病模型，突出了利用基础编辑器2进行基因编辑的优势。

2018 年，Ryu等将ABE7.10包裹到双反式剪接的AAV病毒系统中，递送到Dmd小鼠模型中进行无义突变的较正，成功治疗了杜氏肌营养不良的小鼠疾病表型；Liu等利用BE3碱基编辑系统对兔MSTN 基因进行编辑，使其在外显子的1 处发生胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）的突变，从而提前产生终止密码子使基因无法转录而失活，最终携带该位点突变的突变型兔相较于野生型兔显示出了双肌表型；Li 等结合BE3和体细胞核移植方法，通过在猪胚胎成纤维细胞中编辑Twist2基因和Tyr基因建立了无脸巨口综合征和皮肤白化病的疾病模型。

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