单碱基编辑技术及其在动物育种中的应用研究进展

由于PE于2019年被报道，只在少量类型的细胞中被测定过效率，活体验证结果寥寥无几。Liu等首先构建了单核苷酸突变的小鼠，用PE3系统诱导小鼠N2a 细胞中的X 连接雄激素受体（Ar）基因和同位素蛋白Hox-D13（Hoxd13）基因中的点突变，设计了独特的sgRNA，并在随后的实验结果观察中证明了体外筛选pegRNAs的必要性，揭示了现阶段PE系统体内效率低下的缺陷，作为介绍了使用PE在动物中生成有针对性的碱基突变的第1份报告，这份报告证明了人类细胞中的主要编辑系统在动物中的可行性，为其后PE系统的研究和发展以及使用提供理论基础。

1.2 单碱基编辑技术的优化

1.2.1 碱基编辑效率的优化

Komor等将尿嘧啶羰基化酶抑制蛋白（UGI）融合到BE1系统中，研发了第2代系统BE2，将编辑效率提高至20%。为进一步提高编辑效率，研究团队对dCas9进行了改造，恢复第840位氨基酸突变，保留Asp10Ala变异，使dCas9（A840H）蛋白具有DNA 单链的切口酶活性，这样可以只切割靶位点的非编辑链，使细胞启动错配修复机制（MMR）后只能以含U的单链为模板进行修复，大大提高了编辑效率，该系统被称为BE3，编辑效率达37%。此外，Koblan等通过增加个数不同的核定位信号（Nuclear Localization Signal，NLS）以及使用不同科研人员优化的密码子序列等方法构建了BE4max和AncBE4max这2种可在各种哺乳动物细胞进行高效编辑的碱基编辑器。

第1代腺嘌呤碱基编辑系统ABE1.2效率为3.2%±0.88%，无法满足在研究工作中进行基因编辑的需要，为此Gaudelli等构建了ABE1.2变种库，并提高抗生素筛选浓度，将ABE1.2发展至ABE2.1，提高至14%±2.4% 编辑效率；又将TadA序列与dead Cas9 融合构建成随机突变文库，通过结合卡那霉素、ABE 恢复霉素等抗性基因与相应的抗生素进行筛选，经过先后7轮改造后，将ABE 系统升级至ABE7.10，编辑效率达53.0%，编辑窗口为4~6个核苷酸。2021年，为对现有植物腺嘌呤碱基编辑器进行优化，中国农业科学院植物保护研究所作物有害生物功能基因组研究创新团队对TadA7.10衍生版本TadA8e、TadA8.17、TadA8.20进行评估，并在此基础之上开发出全新版本TadA9，将多个测试靶位点处的碱基编辑效率逐步提高至90%以上，并证实了TadA9 和TadA8e 能与众多Cas9衍生蛋白和同源蛋白广泛兼容，包括SpCas9n、SpCas9n-NG、SpRYn 和ScCas9n。

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