非洲猪瘟病原学检测技术研究进展

摘要：非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家猪和野猪而引起的一种急性烈性、高度接触性传染病，到目前为止仍未研制出有效疫苗，因此病原的早发现对ASF防控尤为重要。ASFV的病原学检测主要包括活病毒检测、核酸检测和抗原检测。活病毒检测中，病毒分离和红细胞吸附试验均耗时较长，且对实验室要求较高，通常只有被参考实验室采用。病毒核酸检测中，普通PCR和实时荧光定量PCR（qPCR）是OIE推荐的首选诊断方法，其特异性和灵敏度均较高，但操作复杂、成本高；等温扩增技术操作简单、成本低，不需要特殊仪器，检测时间短、携带方便、灵敏度高，适用于屠宰场、养殖场现场检测，但因特异性不高，需要不断更新和改进；微流控芯片法具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、便于携带等优点，但检测成本高，需要特定的设备，尚未被广泛使用。抗原检测技术中，荧光抗体检测（FAT）对实验室要求较高，不适合现场检测；夹心ELISA和胶体金免疫试纸条检测快速，操作简单，检测成本低，但敏感性和特异性还需改进。ASF病原学检测技术虽很成熟，但各有不足，所以应根据实际情况结合使用。

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染猪引起的一种热性急性传染性疫病，临床症状表现为体温高热、皮肤充血、多器官出血及流产等症状。ASFV 是非洲猪瘟病毒科（Asfarviridate）的唯一一种病毒，也是唯一一种虫媒传播的双链线性 DNA 病毒，以直接或间接接触以及软蜱吸血途径传播，仅感染猪科动物（不同生长阶段、品种的猪均易感）。ASFV 是大型、似六角形、复杂的二十面体带囊膜的双链线性 DNA 病毒，直径172~260 nm，基因组全长 170~194 kb，其病毒颗粒是由 3 万余个蛋白亚基，17 280 种蛋白质组装成的球形颗粒，是目前解析近原子分辨率结构中最大的病毒颗粒。ASFV 根据病毒是否具有红细胞吸附特性，已鉴定出 8 个血清群，依据编码 p72 蛋白的 B646L 基因的 3' 端序列，目前全球已鉴定出至少 24 种基因型，其中欧洲流行 I 型和 II 型。强毒力基因 II 型 2018 年传入我国，随后蔓延至全国，2021 年 2 月 Sun 等在我国发现基因 II 型自然低毒力毒株，其基因序列发生了不同程度的突变或缺失，导致毒株致病性降低，有明显的残留毒力，引起的临床症状也具有明显的隐蔽性；2021 年 10 月Sun 等从山东和河南两省猪场临床发病猪样品分离出两株基因 I 型毒株，经动物攻击试验发现，其表现出低毒力和有效传播能力，并可导致轻度感染和慢性疾病，而感染这些低毒力毒株的猪不断排出病毒并出现低水平的病毒血症，排毒及病毒血症规律性较差，这给 ASF 的早期诊断和防控带来巨大障碍。为更好地给 ASF 早期诊断和防控提供帮助，就当前的 ASFV 病原学检测技术研究进行了概述。

1　活病毒检测

活病毒检测主要有病毒分离（virus isolation，VI）和红细胞吸附试验（hemadsorption，HAD）。VI 鉴定结合 HAD 是世界动物卫生组织（OIE）确诊 ASF 的“金标准”之一。VI 是将 ASFV 从猪血液、肺（肺泡）单核细胞或巨噬细胞中分离出来，镜下观察是否有细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）；HAD 是根据红细胞聚集在 ASFV 感染的巨噬细胞周围，观察细胞表面是否有“玫瑰花环”或“桑葚状”现象。但这些方法试验周期较长，所需设备昂贵，对技术人员素质、实验室生物安全条件等方面要求较高，必须在具有生物安全三级以上实验室中进行，且目前只有少数实验室能从事ASFV 分离、鉴定、活病毒培养、动物接种试验等，因此并不适用于现场检测，通常适用于 ASFV 致病机制和分子生物学表征的研究及疫苗的研发。

ASFV 分离最早使用猪原代巨噬细胞，且必须是猪身上的新鲜分离的血液才行，而大多数兽医诊断实验室通常是不易获得的。Rai 等从非洲绿猴肾上皮细胞中分离到商业化的细胞系 MA-104（猴胚胎肾细胞），能从不是新鲜的血液样品中检测ASFV，其灵敏度与原代猪巨噬细胞相当。近期又有文献报道，ASFV 能在 ZMAC-4（胎猪肺巨噬细胞）、WSL（野猪肺细胞）和 IPKM（猪肾巨噬细胞）中高效复制，这些可替代的细胞能节省大量的前置时间。而 1963 年 Tubiash 等在西班牙首次发现 ASFV 不吸附红细胞。2021 年 Sun 等在我国分离出 22 株自然变异株，其中有 11 株因基因突变或缺失阻止病毒翻译完整的 CD2v 蛋白，导致病毒粒子失去吸附红细胞表型的能力。因此，不具有红细胞吸附现象的 ASFV 毒株，并不适用于此方法来进行鉴定，进一步确诊需要对病毒分离培养物采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）等方法进行检测鉴定。

2　病毒核酸检测

病毒核酸检测是针对 ASFV 核酸序列的，常用方法有 PCR、qPCR、微流控芯片法、等温扩增技术，其中 PCR 和 qPCR 是 OIE 推荐的首选确诊技术。不同方法有其各自的特点，具体见表 1。

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