非洲猪瘟诊断技术研究进展（二）

2.2 抗原检测

2.2.1 荧光抗体试验（fl uorescent antibody test，FAT）　FAT 是检测抗原的一种辅助方法，具有快速、方便、敏感、特异等特点，而且可以鉴别“非红细胞吸附”的毒株，也能区分由 ASFV 引起的 CPE 和由其他病毒、接种物细胞毒性产生的CPE，可作为 HAD 试验的补充试验进行进一步检测。FAT 需用荧光素对抗原进行标记，但对荧光素的特异性要求较高，非特异性的荧光素染色会造 成假阳性结果；对于急性 ASF 检出率较高，对于 亚急性和慢性 ASF 的检出率仅为 40%；对人员要求较高，需要荧光显微镜，不适用于现场检测。

2.2.2 抗原ELISA ELISA检测的原理为抗体（抗原）被吸附在固相载体表面，样品中的抗体或抗原与其结合形成复合物，酶标抗体再与该复合物结合，根据加入底物后颜色反应判定结果。Vidal 等  基于抗 vp73 单克隆抗体建立了一种用单克隆抗体检测猪样品中 ASFV 蛋白的改良固相 ELISA，检测到 vp73 的最低抗原质量浓度为 0.05 μg/mL，低于普通 ELISA 试验检测最极限（0.5 μg/mL）。

2.2.3 侧向流动免疫色谱分析（lateral fl owassay，LFA）　LFA 又称“试纸条”测定方法，是近几年来发展比较迅速的试纸条快速检测技术，其以条状纤维层析材料为固相，借助毛细管的吸附作用使样品在层析材料上移动，样品中的待测物与层 析材料上一定区域的配体发生特异性的免疫结合反应，可通过目测标记物的显色反应短时间获得直观的测试结果。Sastre 等基于 ASFV vp72 蛋白的单克隆抗体建立的一种用于抗原检测的 LFA，其灵敏度与市售抗原 ELISA 试验相当。该法具有快速、特异、经济 易于使用的优点。此外，该法可直接用于检测血液，非常适合现场检测，及实验基础设施不足甚至缺乏的场所。

2.3 常用检测技术比较

目前 ASFV 常用检测方法主要表现在病原、核酸、抗原与抗体 4 个方面，其中病原检测主要有红细胞吸附和病毒分离方法，核酸检测主要通过普通 PCR、qPCR 与 RPA 等方法，抗原检测常 用抗原 ELISA 与 LFA 等，而抗体可通过 GICA、ELISA、IFA 与 IBT 等方法检测（表 1）。每种诊断技术都有其特点，可为不同情况下的 ASFV 诊断提供多种选择。qPCR 敏感性高、特异性强，可以快速对 ASFV 进行定量分析，是诊断 ASFV 感染最可靠的“金标准”，但是需要专业人员操作而且对设备要求高。mPCR 可以同时检测及区分ASFV 及多种病毒感染，节约了大量时间，但操作步骤繁琐。LAMP 技术是一种特异、灵敏、快速、 简单易用且经济高效的 ASFV 核酸检测手段，可在现场检测，检测结果可以立即用肉眼观察到，但 是操作过程中易造成气溶胶污染，形成假阳性。抗 原 ELISA 可用作检测猪群体 ASFV 抗体，操作简便快速，但敏感性低于 PCR。LFA 是近年来发展迅速的新检测方法，具有快速、特异性强、灵敏度高、成本低的优点，适用于现场检测及一些缺乏基 础实验设施的场所，具有很好的应用前景，但该方法不能对抗原绝对定量而且需要两个抗原表位。

表1 ASFV 常用检测方法及其优缺点

3　展望

ASF 给我国养猪业带来了沉重打击，而2021 年以来，在我国又出现了变异毒株，使 ASFV防控愈加困难。目前，OIE 批准的诊断方法主要包括病毒分离、FAT、ELISA、IFA、PCR 和 IBT。这些方法往往需要昂贵的实验室设备和熟练的技术人员，并且在现有的诊断技术中，缺乏能鉴别 ASFV病理变化的病原学诊断方法。而快速、简便、可靠 的 ASF 诊断和监测方法对于控制 ASF 格外重要。CRISPR 技术与 RPA 结合是目前发展较快的检测技术，具有良好的发展潜力，能将检测灵敏度提高 10 倍，但却增加了更多的反应时间，因此缩短反应时间是今后新的研究方向。在今后的发展中，不同诊断技术的联合应用也将成为未来诊断技术发展的趋势。

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