动物源性食品中有害化学物质及污染物的检测——孔雀石绿

4.4对非靶生物的影响

李红霞等考察了孔雀石绿对小球藻和金藻生长的影响，并研究了孔雀石绿对小球藻中叶绿素含量的影响。结果表明，孔雀石绿对两种藻类的生长具有较强的抑制效应，96h的半抑制效应浓度（EC50）分别为0.133mg/L和0.017mg/L，属于高毒，而且对金藻的毒性大于小球藻，小球藻中叶绿素b和类胡萝卜素的含量随孔雀石绿浓度的增加而明显下降。

5、国内外限量要求

美国、欧盟、加拿大等已经将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。加拿大于1992年就禁止其作为渔场杀菌剂；美国规定在食用水产品中禁止检出孔雀石绿和无色孔雀石绿；欧盟于2002年6月颁布法令禁止在渔场中使用孔雀石绿。而我国也于2002年5月将其列入«食品动物禁用兽药及其化合物清单»，禁止用于所有食品动物。

6、样品前处理

如前所述，孔雀石绿在水产品生物中主要以无色孔雀石绿形式存在，并且具有很好的亲脂性。而水产品基质化学成分复杂，脂肪含量较高，不利于目标分析物的提取和净化。

大多数研究者都采用乙腈、乙酸胺盐等缓冲溶液来提取孔雀石绿及其代谢物，然后离心分离，经过液-液萃取、固相萃取等净化技术来获得。

6.1提取

孔雀石绿易溶于水，样品中以阳离子形式存在。无色孔雀石绿极性弱，易溶于有机溶剂。一般采用的提取溶液为甲醇和乙腈，由于甲醇对样品基质成分具有较强的溶解性，提取液干扰成分多，一般选用乙腈作为提取溶液。提取时常加入离子对试剂对甲苯磺酸，有利于孔雀石绿及无色孔雀石绿形成离子对，增加乙腈对这两种物质的提取效率，提取溶剂中水相和乙腈的比率也影响样品的回收率。根据相关文献报道，目前主要采用的缓冲盐体系有Mcllvainer缓冲液（pH3.0）、乙酸铵缓冲液（pH4.5）以及2%的三氯乙酸、6%的高氯酸和10%的磷酸的缓冲液体系，它们的主要作用就是使样品可食性组织中蛋白质变性，从而使目标化合物能够很好地被提取出来。吴学立对三种缓冲液体系做了对比研究，结果表明Mcllvainer缓冲液（pH3.0）对孔雀石绿及其代谢物无色孔雀石绿有非常稳定的提取效果和较好的回收率，其绝对回收率达到50.4%；使用乙酸铵缓冲液（pH4.5）也有比较好的回收率，其绝对回收率达到45.8%；而使用2%的三氯乙酸、6%的高氯酸和10%的磷酸的缓冲液体系则回收率偏低，仅为24.6%。

孔雀石绿及其代谢物无色孔雀石绿不稳定，容易发生降解，特别是无色孔雀石绿，这种降解最有可能是去甲基化而变成N，N′，N″-三甲基或N，N′-二甲基的化合物。样品提取时常加入还原剂有助于防止待测物的降解。根据文献报道，目前使用的还原剂主要有盐酸羟胺、TMPD（N，N，N′，N′-四甲基对苯二胺盐酸盐）及抗坏血酸。吴学立对三种还原剂做了对比试验，结果显示加入三种还原剂均可以减少损失、提高分析物回收率。加入TMPD分析物回收率稍高于盐酸羟胺及抗坏血酸，但差异不显著。

詹月华等通过L9（34）正交试验确定了水产品中孔雀石绿残留的最佳提取剂配方及提取技术：在5g鱼肉样品中分别加入酸性氧化铝2.0g、PbO2和硅藻土混合物（1∶2）0.6g、pH3.5乙酸盐缓冲溶液7.5mL、1mol/L的对甲苯磺酸溶液2.5mL、乙腈10mL，经充分研磨、匀浆之后，3 000r/min离心取上清液。

6.2净化

上述提取液经过二氯甲烷萃取后，去除了盐等水溶性物质，但仍含有油脂、色素等基体。这些基体对检测有非常大的干扰。许多研究通常采用氧化铝及固相萃取（SPE）等技术达到净化提取液的目的。

相关文献报道，目前大多采用酸性氧化铝、碱性氧化铝来吸附提取液中的杂质，吴学立在提取过程中加入氧化铝脱脂对草鱼、鳗、虾及贝有非常显著的效果，但对三文鱼效果不显著。这可能是因为三文鱼的油脂、色素含量要高于草鱼、鳗、虾及贝。同时对酸性氧化铝、碱性氧化铝及中性氧化铝都进行了对比试验。结果显示碱性氧化铝对杂质的吸附效果稍好于其他两种氧化铝。氧化铝在提取液中存在一个动态平衡，它在对杂质的吸附过程中同时也对目标化合物进行吸附，但对杂质吸附效果大于目标化合物时，回收率显著增加；当对杂质吸附效果小于对目标化合物时，回收率显著降低。

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