动物源性食品中有害化学物质及污染物的检测——孔雀石绿

7.1.5 GC-MS

无色孔雀石绿是易挥发的有机物，可以利用这一特性用GC-MS检测无色孔雀石绿。由于无色孔雀石绿在动物体内代谢速度慢，残留期长，阳性样品主要是无色孔雀石绿残留，因而采用GC-MS对水产品中无色孔雀石绿残留进行定性检测也具有重要意义。用GC-单四极杆质谱检测无色孔雀石绿，选用12.5mHP-1毛细管柱分离，MS检测器以SIM监测4个离子，进行定性定量分析，GC毛细管柱分离度高，检测结果背景干扰小，检测灵敏度和定性准确性都能满足检测要求。但该法不适用于沸点较高的孔雀石绿的残留检测。

7.1.6 HPLC

孔雀石绿的沸点高，不易挥发，适合采用LC法进行分析鉴定。据Hajee研究，采用正相的氰基（—CN）柱或反相的C18柱都可以实现分离，反相柱的柱效和分离度较好。目前采用C18反相柱分离方式是主流。

要实现同时对孔雀石绿和无色孔雀石绿两种化合物进行检测，主要利用孔雀石绿和无色孔雀石绿的光学特性，孔雀石绿在618nm处有吸收峰，可采用紫外可见检测器检测；而无色孔雀石绿的吸收峰在267nm，同时还具有荧光特性（激发波长265nm，发射波长360nm），因而可采用紫外或荧光检测器（FLD）检测。具体有以下4种主要检测方式。

7.1.6.1 紫外检测器（UVD）检测

检测孔雀石绿常选用二极管阵列检测器（DAD）和UVD。根据出峰时间的不同，用UVD在618nm处检测孔雀石绿，在267nm处检测无色孔雀石绿，两者的最低检测限均为2μg/kg。该方式的缺点主要在于很多有机小分子在267nm处都有吸收，因此无色孔雀石绿目标峰附近干扰峰较多，该方法用于无色孔雀石绿定性和定量的准确性不够理想。

对于618nm的工作波长，DAD的光源稳定性大大优于UVD，究其原因是带氘灯的UVD在该波长条件下能量降低，而且不稳定。DAD可以在其他无吸收波长区域选择一个参比波长如730nm，有助于降低检测基线噪声，而且可以得到样品在多个波长或者一个区域的吸收光谱图，可以进行峰纯度检验。DAD还可以通过优化来提高检测性能。首先做一个400~900nm的吸收扫描，确定618nm为最大吸收波长，然后以618nm为中心，10nm宽度为检测波长区域；以730nm为中心，50nm宽度为参比波长区域。上述DAD的优化设置条件下的检测会大大优于UVD的单波长检测。

李永夫等利用DAD的优点，以乙腈-0.05mol/L乙酸钠（55∶45）为流动相，以618nm为检测波长，建立了用DAD检测的HPLC法。该方法对孔雀石绿和无色孔雀石绿的检测限分别为1μg/kg和2g/kg，加标回收率分别为85.7%~89.7%和87.6%~91.2%。

7.1.6.2 UVD和FLD串联检测

Mitrowska等没有使用氧化铅柱，而是联合利用UVD和FLD，经HPLC分离后分别对孔雀石绿和无色孔雀石绿进行检测。该方法充分利用UVD和FLD的优点，采用UVD在618nm外检测孔雀石绿，FLD则采用激发波长（265nm）、发射波长（360nm）检测无色孔雀石绿。该方法对无色孔雀石绿和孔雀石绿的灵敏度分别达0.5μg/kg和2μg/kg。此方法虽然检出限达到要求，但无法对阳性结果进行确证。

7.1.6.3 FLD检测

GB/T20361—2006采用这种检测方法，在样品前处理过程中加入硼氢化钾，将孔雀石绿还原成无色孔雀石绿，然后采用FLD进行定量检测。该方法利用了无色孔雀石绿的荧光特性和FLD的高灵敏度、选择性，有效地提高了检测灵敏度，检出限可达05μg/kg。该方法不足之处是对样品前处理要求较高，在处理过程中很难保证所有的孔雀石绿都转化成无色孔雀石绿，影响方法的稳定性。

Roybal、Hajee、Bergwerff分别对鲇肌肉组织，鳗血浆中，鲇、鳗鲡、鲑、大菱鲆、对虾中孔雀石绿及无色孔雀石绿残留进行了研究，检测限为23μg/kg、21μg/kg，5μg/kg、0.9μg/kg，1μg/kg、1μg/kg，回收率分别为72.9%、87.4%，82%、83%，43.8%~67.0%、86%~105%。郭德华用HPLC（—CN柱）对鳗组织中的孔雀石绿残留进行了检测，检出限为1μg/kg，回收率为93.5%~99.6%。郑斌等建立了用HPLC-FLD法测定鳗鲡中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法。样品中残留的孔雀石绿或结晶紫用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物无色孔雀石绿或隐色结晶紫，用乙腈、乙酸铵缓冲溶液提取、二氯甲烷液-液萃取、PRSSPE柱净化、反相色谱柱分离、FLD检测、外标法定量。孔雀石绿和结晶紫混合标准工作溶液质量浓度范围为1~600μg/L时，该方法的线性关系极好，相关系数均为0.999 9。该方法定量检出限为0.4μg/kg。当空白样品中孔雀石绿和结晶紫添加水平为0.4~100μg/kg时，孔雀石绿回收率为70.0%~90.6%，结晶紫回收率为73.0%~87.2%，相对标准偏差均小于10%。

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