非洲猪瘟病毒在野猪尸体内的存活研究

摘要：自1957年非洲猪瘟(ASF)首次传入欧洲野猪种群以来，人们一直在讨论死于非洲猪瘟的动物尸体中病毒的存活问题。众所周知，非洲猪瘟病毒(ASFV)在环境中非常稳定，因此，感染非洲猪瘟的野猪尸体很可能是非洲猪瘟病毒的主要宿主，对该病毒在野猪种群中维持和传播起着重要的作用。为最大限度地降低这一风险，清除非洲猪瘟感染区的野猪尸体被认为是有效控制非洲猪瘟的关键措施。如果无法清除，通常就地掩埋野猪尸体，以避免野猪和该传染源直接接触。本研究中，将立陶宛在不同时间不同地点掩埋的感染非洲猪瘟病毒的野猪尸体挖掘出来，并采用体外试验重新检测了感染性非洲猪瘟病毒的存在情况，采用qPCR方法重新检测了病毒基因组。另外，还对可能被体液污染的土壤样品进行了病毒基因组检测。在20个掩埋点中，有17个掩埋点挖出的野猪尸体样品中检测出了非洲猪瘟病毒基因组。然而，所有的尸体标本中均未分离出非洲猪瘟毒株。在7个掩埋点的土壤样品中含有非洲猪瘟病毒DNA。这些结果出乎意料地否定了野猪尸体中传染性非洲猪瘟病毒能够长期存活而不受掩埋时间影响的观点。在这种情况下，必须进一步研究从尸体标本中分离非洲猪瘟毒株的敏感性、动物的易感性以及口服接种所需的剂量。此外，还需要研究在野猪感染循环中其它的非洲猪瘟感染源和驱动因素。

1 概述

非洲猪瘟(ASF)影响所有猪科动物种群。尽管非洲本土野猪(例如疣猪)感染非洲猪瘟病毒后不表现临床症状(Thomson, Gainaru,& Van Dellen, 1980)，但却可以导致家猪和欧亚野猪(Sus scrofa)发病严重。过去十年由于其广泛传播，非洲猪瘟已成为全球养猪业的巨大威胁(Sánchez-Cordón, Montoya, Reis,& Dixon, 2018)。由于没有疫苗和治疗方法，采取生物安全措施和扑杀是养猪场抗击非洲猪瘟的唯一手段。只要及早发现感染非洲猪瘟的养猪场并采取所有措施，再加上适当的清洗和消毒措施，就可将非洲猪瘟进一步传播的风险降至最低(Zani 等人,2019)。如果野猪感染非洲猪瘟，情况就复杂得多。必须根据当地情况，确定感染区域并制定非洲猪瘟控制策略，如禁止狩猎或设置围栏限制野猪移动(欧洲食品安全局动物卫生和福利委员会，2018)。由于感染非洲猪瘟的野猪尸体可能是感染源，因此必须尽快找到并清除。最安全的尸体处理方式是采取防病毒泄漏的措施收集感染尸体并运往焚化厂进行处理(Depner 等,2017)。不过，如果场地难以进入或植被茂密，清除尸体并运输到焚化厂可能存在问题，甚至不可能。在大多数国家，出于环境考虑，严禁现场焚烧尸体。在立陶宛，由于没有处理野猪尸体的化制厂，联合国粮食及农业组织建议就地掩埋野猪尸体(Miller & Flory, 2018)，以减少疫病传播的风险。由于立陶宛森林面积广且十分偏远，土壤也适合挖掘，因此自2014年立陶宛暴发非洲猪瘟疫情以来，就掩埋了大量野猪尸体(Pautienius 等,2018)。在本研究中，对2017-2018年立陶宛在不同时间和地点掩埋的野猪尸体挖掘出，并检测传染性非洲猪瘟病毒及其病毒DNA的存在情况，以研究野猪尸体中病毒存活的情况。肉制品(Mebus 等人, 1997;Petrini 等,2019)、猪的排泄物(Davies 等,2017)和不同环境样品中(欧洲食品安全局动物健康与福利委员会,2014)病毒的存活情况已有一些研究。不过，主要是对来自实验感染的动物样品或对照样品进行了检测。为评估在野外条件下的样品数据是否准确，我们调查了立陶宛死于非洲猪瘟、但无法清除而掩埋的野猪尸体的样本。。并对骨髓、周围土壤以及残留的器官基质进行了取样和检测。

2 材料与方法

2.1 研究设计

立陶宛环境部和立陶宛国家食品和兽医局已批准挖掘野猪尸体，包括挖掘点和周围地区的净化措施。作为疫病控制措施的一部分，2018年10月8日至11日在立陶宛20个不同掩埋(见图S1)挖出野猪尸体，通过定量聚合酶链反应(qPCR)检测初步发现感染非洲猪瘟。从每具挖掘的尸体中提取骨髓(如有)和残余器官的基质。此外，在每个挖掘现场对土壤进行取样，在腐烂的尸体旁边随机抽取3个样品。为更好地比较，对每个尸体样品的分解状况进行了等级评分。评分①表示尸体大体完整，皮肤闭合，器官可识别。被肢解或切开但有残余组织的尸体评分为②，仅留下骨头的尸体评分为③(见图1)。挖掘取样后，尸体再次就地掩埋。使用含有过氧化物、表面活性剂、有机酸和无机缓冲系统(Virkon®S,Lanxess)的广谱消毒剂处理局部土壤表面和所有相关仪器。为避免无意中灭活尸体样本中的病毒，采样过程完成后严格使用消毒剂。之后，获得的标本在立陶宛国家食品和兽医风险评估研究所和德国的弗里德里希-莱弗勒研究所(FLI)进行qPCR检测和病毒分离。

2.2 实验室调查

2.2.1 样品处理

样品收集后保存在−80°C的环境中，以待后续使用。为进行qPCR和病毒分离，使用Qiagen公司的组织研磨机TissueLyser II将骨髓样品用5 mm不锈钢珠均匀研磨后，置于1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。组织样品在无菌砂土中用杵和研钵均匀研磨。

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