非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

摘要：为建立一种检测非洲猪瘟病毒（ASFV）抗体的间接ELISA（iELISA）方法，对构建的ASFV P30基因表达工程菌诱导表达后，将获取的重组ASFV P30蛋白进行纯化和Western-blot检测，然后以纯化的重组蛋白为抗原，建立了ASFV抗体iELISA检测方法，并进行了特异性、灵敏性、重复性试验；同时与基于ASFV P30-2His6蛋白（N、C末端各融合1个His6标签）的iELISA方法进行兽医临床样本比较试验。结果显示：重组ASFV P30蛋白和重组ASFV P30-2His6蛋白在Western-blot检测中，均能与猪ASFV阳性血清产生特异性杂交带；基于重组ASFV P30蛋白iELISA的最佳反应条件为，抗原蛋白包被质量浓度20 μg/mL、血清样品稀释度1:1 000、酶标二抗稀释度1:40 000、血清样品检测OD450阳性结果临界值0.22。该方法仅对ASFV阳性血清呈特异性反应，1:3 200稀释的阳性血清仍可检出，批内试验和批间试验变异系数均小于10%，可以消除His标签所造成的假阳性反应。本研究建立的ASFV P30 iELISA检测方法为ASFV抗体检测提供了一种有效手段。

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是一种对家猪和欧亚野猪具有极高致死性和传染性的病毒性疫病，给世界生猪养殖业造成了巨大经济损失，被世界动物卫生组织（OIE）列入须通报动物疫病名录。1909年，ASF在肯尼亚定居者饲养的猪中被首次发现，1921年Montgomery将其作为一种有别于传统猪瘟的疫病进行了报道；1957—1960年，ASF先后两次从西非传播到葡萄牙，继而传播到加勒比地区以及巴西和欧洲的其他国家。2018年8月，我国报告了首起ASF疫情，随后疫情迅速在全国传播，给我国生猪养殖业造成了巨大经济损失。

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是引起ASF的病原体。ASFV是一种二十面体的大型包膜病毒，双链DNA基因组长度为170~190 kb，基因组含有160~175个开放阅读框（ORF），编码150~200种蛋白质。这些编码蛋白中的主要结构蛋白包括：A238L蛋白、CD2v蛋白、多基因家族蛋白、P54蛋白、P72蛋白和P32蛋白。其中，P32蛋白由CP204L基因编码，相对分子质量约为30 ku，也被称为P30蛋白。该蛋白在病毒进入宿主细胞过程中起重要作用，有良好的抗原性，可在感染早期表达和分泌，常被用于感染后免疫反应的早期检测，是一种理想的血清学诊断和免疫学检测抗原。

近年来，各种基因工程亚单位疫苗在我国动物疫苗生产企业中被广泛研制。这些疫苗蛋白中许多含有多聚组氨酸标签。猪群使用带组氨酸标签的疫苗后，会产生相应的抗多聚组氨酸抗体。在兽医临床检验过程中，如果包被抗原中也含有多聚组氨酸标签，就会出现抗体假阳性的检测结果。为了消除抗多聚组氨酸抗体的影响，本研究利用大肠杆菌表达并纯化了不含多聚组氨酸标签的重组ASFV P30蛋白，并以它作为间接ELISA（iELISA）的包被抗原，建立了一种ASFV抗体iELISA检测试剂盒，同时与带组氨酸标签的ASFV P30-2His6蛋白iELISA检测方法比较，发现使用不含多聚组氨酸标签的重组ASFV P30抗原作为包被抗原，能消除多聚组氨酸抗体造成的假阳性反应。本方法的建立为ASFV早期感染检测及其疫苗免疫效果评价提供了一种可靠的方法。

1 材料与方法

1.1 血清样品

猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）阳性血清，由长江大学生物医药研究所保存并提供；猪塞内卡病毒（senecavirus A，SVA）阳性血清，由哈尔滨兽医研究所翁长江研究员惠赠；猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）阳性血清、猪口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）阳性血清、猪圆环病毒3型（porcine circovirus 3，PCV3）阳性血清，由青岛易邦生物工程有限公司提供；ASFV阳性血清（15份，由中国动物卫生与流行病学中心国家非洲猪瘟参考实验室提供），ASFV临床阴性血清（40份，由青岛易邦生物工程有限公司提供），均通过法国爱迪威ASFV iELISA抗体检测试剂盒（ID.vet试剂盒）和Western blot方法检测确认。

1.2 重组蛋白构建和诱导表达

根据Miao等于2018年10月在GenBank上发布的ASFV全基因序列（ACCESSION：MH766894），设计ASFV P30蛋白全基因编码序列，并在序列的5'末端加上BamH I限制性核酸内切位点序列，同时去掉原序列3'末端的终止密码子并加上Xho I酶切位点。设计序列送交北京美吉桑格生物医药科技有限公司进行全基因合成，并插入在表达质粒载体pET28a相应的酶切位点上。用带有ASFV P30蛋白编码序列的pET-28a质粒（pET-28a-ASFV P30-2His6）转化至E.coli.BL21的感受态细胞，即得到E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30-2His6。用该工程菌诱导表达的ASFV P30蛋白上、下游各有1组His6标签。该菌种由本实验室前期构建并保藏。

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