动物源性食品中细菌的检测——金黄色葡萄球菌

  其他食品可参考上述食品处理方法。

  检测：所有操作均应在室温（20～25℃）下进行，A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型ELISA检测试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温方可使用。测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头，用过的吸头及废液要浸泡到10%次氯酸钠溶液中过夜。将所需数量的微孔条插入框架中（一个样品需要一个微孔条）。将样品液加入微孔条的A～G孔，每孔100μL。H孔加100μL的阳性对照，用手轻拍微孔板充分混匀，用黏胶纸封住微孔以防溶液挥发，置室温下孵育1h。将孔中液体倾倒至含10%次氯酸钠溶液的容器中，并在吸水纸上拍打几次以确保孔内不残留液体。每孔用微量多通道加样器注入250μL的洗液，再倾倒掉并在吸水纸上拍干。重复以上洗板操作4次。本步骤也可由自动洗板机完成。每孔加入100μL的酶标抗体，用手轻拍微孔板充分混匀，置室温下孵育1h。重复洗板程序。加50μL的TMB底物和50μL的发色剂至每个微孔中，轻拍混匀，室温黑暗避光处孵育30min。加入100μL的2mol/L硫酸终止液，轻拍混匀，30min内用酶标仪在450nm波长条件下测量每个微孔溶液的OD值。

  结果判定：样品OD值/阴性对照OD值，比值大于2为阳性，小于2为阴性。

  4.4 PCR方法检测金黄色葡萄球菌

  （1）原理 以PCR技术为主的生物技术手段在金黄色葡萄球菌检测方面的应用，除了主要针对该菌的致病性基因外，近年来很多学者逐渐探索了一些很有种属特异性的鉴别基因，主要包括耐热核酸酶基因。耐热核酸酶是金黄色葡萄球菌的特异性酶，通过检测该酶基因可以鉴定金黄色葡萄球菌，均有较好的专一性和准确性。田静等（2007）建立了用PCR方法快速检测牛奶、冰激凌及肉中的金黄色葡萄球菌，灵敏度为10CFU/g（mL），全部检测可在24h内完成。用该方法对人工污染金黄色葡萄球菌的牛奶样品进行检测，结果表明，牛奶中金黄色葡萄球菌量≥10CFU/mL时可通过6～8h增菌后检出。

  （2）仪器设备 PCR仪，电泳仪，凝胶成像系统，台式离心机。

  （3）试剂根据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因序列设计一对引物，扩增片段长度为279bp。上游引物序列：5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′；下游引物序列：5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′。

  （4）操作步骤

  检测样品模板DNA的制备：取10g（mL）样品，常规无菌处理后，加入90mL营养肉汤培养基中，37℃振荡过夜培养（16～20h）。取0.5mL培养液与1mL灭菌PBS（0.05mol/L，pH7.4）混合，9000r/min离心3min，沉淀用PBS洗涤3次，水洗1次，用05mL水重悬沉淀。沸水浴10min，迅速在冷水中冷却，8000r/min离心10min，取上清，即DNA模板溶液。

  PCR扩增：反应体系为25μL：DNA模板4μL、引物（10μmol/L）各2μL、dNTP（25mmol/L）4μL、MgCL2（25mmol/L）3μL、10×PCRbuffer2.5μL、TaqDNA聚合酶1.5μL。

  PCR反应循环条件：94℃预变性5min，按照94℃变性1min、55℃退火45s、72℃延伸45s进行35个循环，最后72℃延伸5min。

  结果检测：取5～10μLPCR扩增产物用含0.5μg/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统分析，观察显示出279bpDNA扩增条带的即可判定为金黄色葡萄球菌。