动物源性食品中细菌的检测——金黄色葡萄球菌

  （3）操作步骤

  样品的处理：称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000～10000r/min均质1～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀。

  增菌和分离培养：将上述样液于（36±1）℃培养18～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈浑浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈浑浊生长。

  将上述培养物划线接种到Baird-Parker平板和血琼脂平板，血琼脂平板于（36±1）℃培养18～24h；Baird-Parker平板于（36±1）℃培养18～24h或45～48h。

  金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无浑浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙且干燥。

  金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

  革兰氏染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢，无荚膜，直径约0.5～1μm。

  血浆凝固酶试验：挑取Baird-Parker平板或血琼脂平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂斜面上，于（36±1）℃培养18～24h。取新鲜兔血浆0.5mL置于小试管中，再加入BHI培养物0.2～0.3mL，振荡摇匀，置（36±1）℃温箱或水浴箱内，观察6h，每0.5h观察一次，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌标准菌株的肉汤培养物做对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。

  结果可疑时挑取营养琼脂斜面的菌落到5mLBHI中，于（36±1）℃培养18～48h，重复试验。

  4.2PetrifilmTM金黄色葡萄球菌测试片法

  （1）原理 PetrifilmTM金黄色葡萄球菌测试片是一种预先制备好的快速检验系统。它含有具有显色功能并经改良的Baird-Parker培养基，对金黄色葡萄球菌具有很强的选择性，并含有冷水可溶性胶。测试片上的紫红色菌落为金黄色葡萄球菌。当测试片上出现除紫红色以外的其他任何颜色（如黑色或蓝绿色），则必须使用确认反应片。此确认反应片含有显色剂和DNA。金黄色葡萄球菌产生的DNA酶会和反应片中的显色剂形成粉红色晕圈。

  （2）设备和材料 恒温培养箱[（36±1）℃]、均质器、pH计或精密pH试纸、放大镜或（和）菌落计数器。

  （3）培养基和试剂 无菌生理盐水、1mol/L氢氧化钠、1mol/L盐酸、PetrifilmTM金黄色葡萄球菌测试片、PetrifilmTM金黄色葡萄球菌确认反应片。

  （4）检测步骤

  样品制备：固体或半固体食品以无菌操作称取25g样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1～2min，制成1∶10样品匀液。液体食品直接用灭菌吸管吸取25mL样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振摇制成1∶10样品匀液。

  在无菌条件下将上述样品匀液的pH调为6.0～8.0对酸性样液用1mol/L氢氧化钠调节、碱性样液用1mol/L盐酸调节，备用。

  接种：将上述制备好的样品匀液做10倍递增稀释，选择适宜的2～3个连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）接种PetrifilmTM测试片，每个稀释度接种2片，每片1mL。将测试片置于平坦表面处，揭开上层膜，用吸管吸取某一稀释度的1mL样液垂直滴加到一张测试片的中央处，然后将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生，切勿使上层膜直接落下，再把PetrifilmTM金黄色葡萄球菌测试片的压板放置在上层膜的中央处，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面上，拿起压板，静置至少1min使培养基凝固。

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