非洲猪瘟病原学检测方法研究进展

3.4　数字 PCR 法

数字 PCR（digital PCR，dPCR）是第三代PCR技术，具有高灵敏度、高精确性、高耐受性、绝对定量等特点。邬旭龙等根据 ASFV K205R基因设计 1 对特异性引物和 TaqMan 探针，建立了 ASFV 实时荧光定量 PCR 和微滴式数字 PCR（droplet digital PCR，ddPCR）检测方法。经检测，建立的 ASFV 荧光定量 PCR 和 ddPCR 检测方法线性关系较好（R2 ≥ 0.998），ddPCR 的最低检出限可达到 0.36 拷贝 DNA，在 20 μL 反应体系中约为10 拷贝 / 反应，具有很高的特异性和重复性，且不与其他常见猪病病毒发生交叉反应。

3.5　生物传感器法

Biagetti 等基于 DNA/LNA 探针与 VP72 靶基因保守区互补配对，建立了 ASFV 生物传感器检测方法。该方法最低检出限为 178 拷贝 /μL 基因组 DNA，定量限为 245 拷贝 /μL DNA，可一次性检测 40 份样品，单次测试时间仅需要 5 min。在ASFV 临床感染样品检测中，与 OIE 推荐的荧光定量 PCR 方法具有极好的相关性。

3.6　原位杂交法

Ballester 等使用原位杂交技术，用地高辛标记的探针检测福尔马林固定、石蜡包埋组织中的ASFV 基因组 DNA，并取得较好的检测效果。

4　小结

目前，根据我国 ASF 防控政策，ASFV 分离、鉴定工作仅能在许可的实验室中开展。胶体金试纸条、ELISA等免疫学病原检测方法，使用方便、快速，但受限于敏感性和特异性，目前主要应用于急性发病或病死猪的快速诊断及群体筛查；分子生物学检测方法仍是 ASFV 病原检测的主要手段，特别是荧光定量 PCR 方法以其敏感、特异、快速、稳定的优点在我国实践中广泛应用。

应用 ASFV 分子生物学检测方法时，应注意如下两方面：（1）分子检测方法是对 ASFV 基因组 DNA 进行检测，因此当检测结果为阳性时，仅表示检测样品中存在病毒核酸，并不能说明样品中是否具有感染性的病毒粒子，如火腿、肉肠、血粉等产品检测结果为阳性时，应综合考虑其加工工艺，也就是通过高温煮熟、熏制等是否足以杀灭病毒。（2）应注意分析结果的准确性，在检测过程中适当增加对照及质控样品。分子检测方法灵敏度较高，当样品处理时出现样品间交叉污染，或是由于扩增产物造成环境污染等，易出现假阳性结果；当样品腐败变质，或是在反应体系中存在扩增反应抑制成分时，易造成结果的假阴性。

当前，微流控、化学发光、基因芯片等新技术开始不断应用于动物疫病检测领域，各种自动化、一体化、便携式或高通量设备不断被研发，未来ASFV 病原学检测将更加快速、准确及自动化，必会进一步为 ASF 防控提供有效支持。

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