非洲猪瘟病原学检测方法研究进展

3　分子生物学检测方法

与免疫学检测技术相比，分子生物学方法通常更加敏感、特异，且同样适宜于高通量检测。OIE 在《陆生动物诊断实验和疫苗手册》中推荐了PCR 检测法，并常作为 ASFV 检测的“金标准”。此外，国内外学者还进行了线性指数 PCR、数字PCR、重组酶聚合酶扩增等方法的探索。

3.1　常规 PCR 检测法

基于凝胶电泳的常规 PCR 检测方法， 其ASFV 最低检出限多为几十到上百拷贝的 DNA。Agüero 等基于 VP72 基因设计建立了常规 PCR检测方法，可以检测到 0.12 HAU50 的 ASFV 且具有良好的特异性，是目前 OIE 推荐的 PCR 检测方法。罗玉子等建立了改良的常规 PCR 方法，其最低检出限可达到 60 拷贝，比 OIE 推荐 PCR 方法更加敏感。崔尚金等建立了新型纳米 PCR 检测方法，最低检出限可达 10 拷贝 DNA。

除了单独检测 ASFV 病原的 PCR 方法，也有同时检测多种猪病的多重 PCR 方法的报道。Hu 等建立了同时检测鉴别 ASFV、猪瘟病毒、高致病性蓝耳病病毒、蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒的多重 PCR 方法，其中 ASFV 最低检出限为1.50×103 拷贝 DNA。

3.2　荧光定量 PCR 检测法

与常规 PCR 相比，荧光定量 PCR 扩增的基因片段更短，通常更加快速、敏感，最低检出限可达几个到几十拷贝的 DNA 模板；同时不需开盖，可减少扩增产物污染的可能，是目前生产实践中ASFV 检测应用最多的一类方法。

King 等依据 VP72 基因建立了基于 TaqMan探针的荧光定量 PCR 方法，最低检出限约为 40 拷贝 DNA，是目前 OIE 推荐的检测方法。Mckillen等根据 9GL 基因设计引物，建立了基于 MGB探针和分子信标探针的荧光定量 PCR 检测方法，最低检出限均达到 20 拷贝 DNA。Ronish 等依据 VP72 基因建立了基于线性指数的 PCR（linearafter-the-exponential PCR，LATE-PCR），最低检出限可达到 1~10 拷贝 DNA。Fernández-Plinero 等采用商品化通用探针库中探针，结合 VP72 基因特异性引物，建立荧光定量 PCR 方法，同时设置猪β-actin 作为内参对照，发现该方法最低检出限为18 拷贝 DNA。

根据探针标记荧光基团的不同，采用荧光定量PCR 方法也可实现多病原的同时检测。Grau 等建立了可从猪唾液样品中同时检测 ASFV、猪瘟病毒、口蹄疫病毒 3 种病原的荧光定量 PCR 方法。

3.3　恒温扩增检测法

恒温扩增检测技术是近年分子诊断研究热点，具有两方面突出优势：一是可以使用水浴设备在单一温度下进行等温反应，无需昂贵的热循环设备，且反应时间短；二是可通过在体系中添加的颜料色彩变化或是在试纸条上形成检测线，直接肉眼判别结果，适合现场检测。

Hjertner 等最早建立了 ASFV 侵染检测（invader assay）恒温扩增技术。该技术能够精确地定量 DNA 和 RNA 靶基因片段，检测 ASFV 最低检出限为 2 500 拷贝 DNA，与猪瘟病毒无交叉反应。虽然此技术敏感性低于其他分子检测方法，但能够检测含有大量 ASFV 的病死猪样品。

James 等建立了 ASFV 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification method，LAMP），其最低检出限为 330 拷贝 DNA。国内学者江彦增等、王彩霞等、杨吉飞等也建立了 LAMP 检测方法，最低检测限可达 10 拷贝DNA。除了通过专用浊度仪生成曲线判定结果之外，LAMP 方法可通过在体系中添加钙黄绿素等颜料，扩增后利用颜色变化方便肉眼判读结果。

李林等建立了实时荧光重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA） 方法。该方法在 20 min 内即可检测 16 拷贝 DNA，且与猪瘟病毒、猪圆环病毒 II 型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应，为我国 ASFV 临床鉴别诊断、检验检疫和病原监测提供了技术支持。Miao 等结合应用试纸条判定 RPA 检测结果，该方法可在 10 min 内检测 150 拷贝 ASFV 的DNA，且与其他猪病无交叉反应。

Fraczyk 等建立了交叉引物扩增方法（crosspriming amplication method，CPA）， 对 VP72 基 因的标准质粒最低检出限达 7.2 拷贝，同时可通过在反应体系中添加 SYBR Green I 染料，阳性扩增产物经紫外光照射产生明亮的绿色荧光，肉眼判定结果。Gao 等将 CPA 技术与试纸条联用，建立了 ASFV 检测方法，可检测 200 拷贝 DNA，在临床样品的检测中，与荧光定量 PCR 方法符合率达97.4%（44/45）。

Wozniakowski 等利用一种新型的聚合酶交叉螺旋反应（polymerase cross-linking spiralreaction，PCLSR），检测猪血中的 ASFV 核酸，该方法可检测 7.2×102 拷贝 /μL 的 VP72 质粒模板，与猪瘟病毒、蓝耳病病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应。

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