非洲猪瘟病原学检测方法研究进展

摘要：目前，非洲猪瘟（ASF）尚无有效疫苗可以预防，快速、准确的病原学检测是防控该病的重要技术手段。本文综述了ASF病原学检测方法：免疫荧光、ELISA、免疫层析试纸条等抗原检测方法，其使用方便、快速，目前主要应用于急性发病或病死猪的快速诊断及群体筛查；PCR、荧光定量PCR、环介导等温扩增等分子生物学检测方法仍是ASF病原检测的主要手段，特别是荧光定量PCR方法以其敏感、特异、快速、稳定的优点在我国实践中广泛应用。随着微流控、化学发光、基因芯片等新技术不断应用，各种自动化、一体化、便携式设备不断研发，将会为ASF防控提供有效技术支持。

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的家猪和野猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，是我国一类动物疫病，世界动物卫生组织（OIE）法定报告动物疫病。我国自 2018 年 8月确诊首起疫情以来，该病已扩散蔓延至除台湾、澳门外全国所有的其他省（直辖市、自治区），给我国养猪业及相关行业造成了巨大的经济损失，甚至影响到肉品市场供应。

目前，本病尚无有效疫苗可以预防，疫病防控主要依靠实施严格的生物安全措施。实现准确、快速的病原学检测是 ASF 防控的基础，可为各项防控措施的制定、实施及评估提供有效支持。本文就相关病源学检测方法进行简要综述，以期为我国ASF 防控和诊断技术研发提供参考。

1　病毒分离

采集猪血液、脾脏、淋巴结等组织样本，接种猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAM）等原代细胞。ASFV 会在易感细胞中复制并产生细胞病变（cytopathic effect，CPE）。在细胞培养中加入猪红细胞后，多数 ASFV 毒株会产生红细胞吸附反应（hemadsorption，HAD），即在感染的白细胞周围吸附猪红细胞形成“玫瑰花环”。由于部分 ASFV 毒株并不产生 HAD，若分离培养物中出现 CPE 而没有出现 HAD，则需采用免疫荧光或 PCR 等方法确认细胞中是否存在 ASFV；如果未出现 CPE，免疫荧光和 PCR 检测也为阴性，需传代 3~5 次，方可确认为阴性。在首次暴发 ASF的地区，经 PCR、免疫荧光等方法检测为阳性的样品，建议采用 HAD 方法进行病毒鉴定。

2　抗原检测

2.1　免疫荧光法

免疫荧光法是OIE推荐的ASF检测方法之一。通过异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记抗 ASFV 特异性抗体，实现脏器涂片或薄层冷冻切片、细胞培养物中的 ASFV 抗原的检测。免疫荧光法是鉴别不产生 HAD 的 ASFV 毒株感染，以及区分 ASFV 与其它病毒（如伪狂犬病毒）产生 CPE 的重要手段。免疫荧光法检测对于急性ASF 感染高度敏感，但在亚急性和慢性感染中，敏感性显著下降，可能与感染组织中已形成抗原抗体复合物，阻断了 ASFV 抗原与检测用抗体的结合有关。

2.2 ELISA 法

Wardley 等采用抗 ASFV 的特异性血清 IgG作为包被蛋白，建立了间接 ELISA 方法，检测ASFV 抗原浓度为 50~500 HAD50/mL。Vidal 等采用抗 ASFV VP72 蛋白的单克隆抗体，建立了夹心ELISA 方法，检测 VP72 抗原浓度为 0.05 μg/mL，全病毒为 2.3×102 PFU/mL。Hutchings 等研究发现采用抗 ASFV 的多克隆抗体，比采用抗 VP72 蛋白单克隆抗体包被蛋白时，检测 ASFV 抗原稍敏感。目前，已有商品化 ASFV 抗原 ELISA 检测试剂盒出售，与荧光定量 PCR 方法相比，具有设备要求低、成本低、操作方便等优势，但敏感性和特异性有待提高。基于此，已有学者和公司将化学发光技术应用于 ELISA 检测结果判定，建立了ASFV 化学发光 ELISA，其检测敏感性显著提升。与免疫荧光法相似，在亚急性和慢性感染中，抗原ELISA 的检测敏感性显著降低。粮农组织（FAO）建议 ELISA 方法用于“群体”样本大规模筛查，并需辅助以其他检测方法。

2.3　免疫层析试纸条法

Sastre 等应用抗 VP72 蛋白单克隆抗体研制免疫层析试纸条。对实验感染猪的 ASFV 血液样品的检测结果表明，该试纸条可检测病毒含量超过104HAU 的样本；临床样品检测结果显示，PCR方法阳性检出率最高，试纸条阳性检测率（60%）高于商品化的抗原检测 ELISA 试剂盒（48%）。吴海涛等以抗 VP72 蛋白单克隆抗体作为金标抗体，以 ASFV 多克隆抗体作为检测线，制备了胶体金试纸条，针对重组 VP72 蛋白的最低检出限在20 ng/mL 左右。刘波以抗 K205 蛋白单克隆抗体作为金标抗体，用兔抗 K205R 蛋白抗体作为检测线，制备的胶体金试纸条针对重组 K205R 蛋白的最低检出限为 30~40 ng/mL。经过多年发展，目前胶体金免疫层析试纸条仍是最成熟，也是普遍应用于 ASF 检测的方法，其临场使用简便、快速，但也存在敏感性低的不足。近年，一些免疫学新技术不断涌现，市面已出现基于乳胶凝集、荧光微球技术研发的非洲猪瘟病原检测用免疫层析试纸条，新方法的运用显著提升了检测敏感性，具有良好应用前景。

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