非洲猪瘟病毒检测方法研究进展

摘要：本文对非洲猪瘟病毒的结构特征及各种检测方法的应用情况进行阐述，比较各种方法的优缺点和适用性，为非洲猪瘟的诊断及防控提供参考。

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswine fever virus,ASFV)引起猪的1种烈性传染病，临床上以急性、热性、出血性、高发病率和高死亡率为特征。ASFV是非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是目前已知的唯一的1个DNA虫媒病毒。ASFV于1921年在非洲肯尼亚首次被报道。1957年传入欧洲国家葡萄牙，此后的70～80年代相继在欧洲和美洲多个国家暴发。2007年传入高加索地区格鲁吉亚，8月、11月分别在亚美尼亚、俄罗斯发现ASF疫情。2012—2014年乌克兰、白俄罗斯、波兰、拉脱维亚和爱沙尼亚相继报道ASF疫情;2017年意大利、捷克和罗马尼亚暴发该病。2018年8月我国辽宁省沈阳市首次报道ASF疫情，此后河南、江苏、浙江、安徽、黑龙江、内蒙古、吉林、天津、山西、云南、湖南和贵州等地相继暴发该病，给养猪业和国民经济造成巨大的经济损失。根据ASFV的p72基因鉴定，2018年8月在我国沈阳分离到的第1例ASFV属于p72基因Ⅱ型，与俄罗斯及东欧目前流行的格鲁吉亚毒株基因型一致，属于同一进化分支。由于目前仍缺乏安全、有效预防的疫苗，我国采取隔离、扑杀、无害化处理、消毒等措施使疫情得到有效控制。ASFV的检测对于疫情的及时处置及防控十分重要。本文就ASFV的结构特征及检测方法进行阐述，供参考。

1 ASFV结构特征

ASFV基因组为线性双链DNA分子，长度为170～193 kb，不同的毒株因基因组可变区长度不同，基因组大小存在差异。目前已知其基因组有151～167个开放阅读框，编码170多种蛋白质，成熟的病毒粒子包含54种结构蛋白。ASFV颗粒是由几个同心区域组成的二十面体形态，中心基因组形成的内核包含核仁。细胞外病毒颗粒具有外部包膜。这种包膜的重要性尚不清楚，目前的研究发现病毒感染不需要这种包膜的参与。根据编码衣壳蛋白p72的B646L基因序列的不同，AFSV至少可以分为24个基因型，根据病毒粒子不同的抗原性可将ASFV分为8个血清型。ASFV可以通过猪之间直接接触传播(如口鼻或皮肤伤口等)。感染猪的血液中有高含量的病毒，也存在于排泄物和分泌物中(如尿液、唾液、粪便等)。有的研究表明，ASFV可通过气溶胶在短距离内传播。该病毒可在肉制品中存活数周或数月，饲喂带毒的餐厨剩余物是导致家猪感染的重要途径。研究表明ASFV抗体对同源毒株具有保护作用。

2 ASFV检测技术

在ASFV尚未传入我国时，国内学者已对ASFV开展了相关研究，常华等在2006年对ASFV的VP73基因进行了克隆和表达，2007年张泉等建立了ASFV常规PCR检测方法，李维彬等建立了ASFV实时荧光定量PCR检测方法，为我国ASFV检测奠定了基础。目前普通PCR与实时荧光定量PCR是实验室常用的检测方法。许多新型的检测技术，如LAMP技术、交叉引物扩增法等也应用于ASFV的检测。

2.1 病原分子生物学检测

2.1.1 普通PCR技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是在模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应，根据碱基互补配对原则，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“变性—退火—延伸”3步反应的多次循环，使DNA片段呈指数扩增。该技术是1985年美国学者Mullis等发明，并于1993年获得诺贝尔奖，主要应用于分子克隆、基因表达、检测等。普通PCR可对扩增反应的终点产物进行定性和半定量分析。鉴定ASFV的PCR引物一般都是根据靶向病毒基因组高度保守区域p72基因设计，具有较高特异性和敏感性，适合各类ASFV毒株的检测。

2.1.2 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是在常规PCR技术的基础上添加荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知浓度模板进行定量分析的方法。与普通PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术最大的优势就是可以实现对PCR反应中的初始模板进行定量，克服了PCR的平台效应，使定量更灵敏、更精准、更特异(可进行单个核苷酸的区分)，普通PCR可对扩增反应的终点产物进行定性和半定量分析，而实时荧光定量PCR技术可以实现对起始模板准确定量，更灵敏，是目前ASFV检测使用最多的方法。

2.1.3 环介导等温扩增技术

随着分子生物学技术的发展，环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)被应用于病毒核酸的检测。此项技术是日本学者Notomi研究开发的1种恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用具有链转换特性的Bst DNA聚合酶在等温条件下恒温几十分钟，使得链转换DNA合成在不停地自我循环，完成核酸扩增反应，用肉眼就可判断结果。2008年王彩霞建立了用于ASFV的LAMP快速检测方法;James H E等也将LAMP技术应用于ASFV的检测。该检测方法针对ASFV的拓扑异构酶基因Ⅱ，其特异性已通过限制性内切酶消化反应的产物得以证实，与实时荧光定量PCR技术之间具有良好的一致性，具有简便、快速、特异性强的特点。

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