七类消毒剂对非瘟病毒荧光定量PCR检测结果的影响

摘要：为评价戊二醛、酚、含碘类等常用消毒剂消毒后对非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测结果的影响，基于畜禽栏舍、运载工具、器具消毒及皮肤黏膜消毒目的，按消毒剂说明书推荐选择不同工作浓度，分别与不同滴度的非洲猪瘟病毒培养物于20 ℃条件下作用30 min后，采用荧光定量PCR方法检测作用后产物。结果显示，与对应的阳性对照组相比，含氯类（二氯异氰尿酸钠）、过硫酸氢钾类、二氧化氯类消毒剂，消毒后对荧光定量PCR检测结果影响最显著，检测Ct值显著上升或检测不到；戊二醛类、含碘类（主要成分聚维酮碘）消毒剂，核酸降解能力相对较弱，检测Ct值稍有上升；酚类、季铵盐类、含碘类（主要成分碘、磷酸、硫酸）类消毒剂，检测Ct值基本无变化。本研究评价了7类常用消毒剂消毒对非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测结果的影响，可为防控实践中科学、客观评价分析消毒效果提供技术参考。

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是我国生猪产业持续健康发展的重大威胁。目前，该病防控依赖于严格的生物安全措施，有效的消毒可直接阻断ASFV传播，是非洲猪瘟（Africanswine fever，ASF）防控的关键。为做好 ASF 防控工作，我国农业农村部发布的《感染非洲猪瘟养殖场恢复生产技术指南》、《非洲猪瘟疫情应急实施方案》（2020 年第二版）、《非洲猪瘟常态化防控技术指南（试行版）》等系列文件中，均对 ASF 防控用消毒剂种类和使用方法进行了推荐。现场消毒后，常需对消毒效果进行评估，实践中最常用方法为荧光定量 PCR。由于消毒剂灭活病毒机制不同，本研究拟采用荧光定量 PCR方法检测戊二醛、酚、含氯等 7 类 9 种常用消毒剂与 ASFV 培养物作用后的产物，评估对检测结果的影响，以期为 ASF 防控实践中科学、客观评价分析消毒效果提供技术参考。

1　材料与方法

1.1　消毒剂

收集市面常见的戊二醛、酚、含碘、季铵盐、含氯、过硫酸氢钾、二氧化氯等 7 类消毒剂，包括戊二醛类 2 种、酚类 1 种，含碘类 2 种、季铵盐 1 种、含氯类 1 种、过硫酸氢钾类 1 种、二氧化氯类 1 种。消毒剂产品详细信息见表 1，所有产品均注册有兽药产品批准文号，试验时均在有效期内。

表1　消毒剂产品信息汇总

1.2　病毒

ASFV 中国分离株：CN2018/1，由国家非洲猪瘟参考实验室分离鉴定并保存。

1.3　试剂与耗材

DMEM 培养基、胎牛血清，购自 GIBCO 公司；细胞瓶及 96 孔细胞板，购自 Corning 公司；病毒RNA/DNA 提取试剂盒，购自天根公司；荧光定量PCR 扩增试剂 Luna 通用探针法 qPCR 预混液，购自 NEB 公司。

1.4　猪肺泡巨噬细胞、红细胞和血清制备

无菌采集健康猪肺脏，向肺脏注入灭菌 PBS灌洗数次，收集灌洗液；离心收集猪肺泡巨噬细胞，按 5×106 个 /mL、100 μL/ 孔接种 96 孔板；铺板次日进行测试。同步无菌采集抗凝血，离心收集血清；之后将细胞沉淀洗涤 3~5 次，弃去白细胞和血小板，用PBS 配成 10% 猪红细胞悬液，4 ℃保存备用。

1.5　病毒滴度测定

采用含 1% 猪血清的 PBS 10 倍连续稀释ASFV 培养物至 10-8，以每孔 100 μL 接种 96 孔板上的猪肺泡巨噬细胞培养物，同时加入 1% 猪红细胞 10 μL，每个稀释度做 4 个重复孔。将 96 孔板置于 37 ℃ 5% CO2 条件下培养 6 d，每天观察，记录并统计各稀释度培养孔中红细胞吸附（HAD）反应结果，采用 Reed-Muench 法计算半数红细胞吸附量（HAD50）。

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