做qPCR，不要钻进“唯Ct值”的牛角尖！

荧光定量PCR（qPCR）是目前病原检测领域使用最为广泛的核酸检测方法（PCR检测技术概述）。尤其是非洲猪瘟和新冠发生后，qPCR检测得到了极大的普及，对于刚刚进入qPCR检测领域的人，很容易钻入了“唯Ct值”的牛角尖，今天我们就聊聊qPCR中的Ct值。

一、Ct值的基本概念

1、什么是Ct值

阈值循环数 Threshold cycle (Ct) 也写作Cq值，荧光信号大于荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline），是由于测量的偶然误差引起的。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节。高于阈值的荧光信号被认为是真实的信号，用于定义Ct值。Ct会受到阈值的影响，每次试验由于样品和仪器的不同会导致基线不同，进而影响阈值和Ct值。

模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系,起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性较好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相对稳定的。

Ct值不是恒定不变的，可以受到不同样品、不同仪器的影响，即使相同的样品在相同的仪器上重复2遍，Ct值也会存在差异。

2、与Ct值有关的参数

标准曲线Standard curve：模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。

相关系数Correlation coefficient (R^2) ：反映了标准曲线的线性，通常要求>0.99。

扩增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反应中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。

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