酶联免疫吸附试验中的注意事项

酶联免疫吸附试验（ELISA）是兽医疫病监测与防控中经常使用的一种试验方法。因其较高的灵敏性和特异性，以及适于批量操作等优点，广泛被应用于抗体或抗原的检测中。但是该试验对试验操作要求较高，一些细节操作不当会对试验结果造成很大偏差。本文就ELISA试验中应注意的一些细节进行探讨。

1  样品的采集和保存

ELISA试验最常用的是血清样品。为了保证试验的准确性，血清的采集和保存尤为重要。首先应避免溶血。因为血红蛋白中的类过氧化物活性物质会与试验过程中的辣根过氧化物酶反应，造成假阳性的发生。其次，样品采集过程中应尽量保证无菌操作，减少污染。为了保证样品的有效物质不被降解，同时避免样品发生腐败，采集的样品于4℃短期保存。如需长期保存，则应-20℃°或-70℃保存，并避免反复冻融。

2  试剂的准备

目前有很多商品化的ELISA试剂盒可供选择，省去了很多试剂的准备工作。但是商品化的试剂盒在使用前也有很多注意事项。首先，ELISA试验对室温的要求一般为18~26℃。有的反应步骤要求37℃恒温。因此，实验室首先得满足实验条件，具备温控系统和恒温箱。在试验前于4℃保存的试剂盒必须恢复至18~26℃后方可使用。应注意每种试剂是否符合实验要求，如检查TMD底物是否已经显色变质，对不符合试验要求的试剂弃用，严禁用于后续试验。

3  温育反应时间的控制

因为ELISA是根据抗原抗体的特异性反应，依据酶标结合物和底物的显色差异来进行试验判断，而酶促反应对反应时间又有很高要求，因而ELISA试验中应严格按照说明书进行操作，缩短或延长反应时间，会造成试验失败和准确性降低。

4  洗板

为了确保ELISA测定的特异性，洗板可清除非特异性结合物质，减少背景信号，增加分析的信噪比。在洗板过程中，应注意避免液体溅出或者加液过程造成的反应孔交叉污染，同时在洗板结束后对板子进行拍干，并用洗耳球吹去反应孔底部的气泡。洗板与下一步的加液过程不应间隔过长时间，否则会造成反应孔底部包被结合物变干。每一步孵育过程均应对反应板加盖封口膜，以防液体挥发。