2015—2019年广西部分猪场病死猪5种病毒的抗原检测

1.2　主要试剂

DL 2 000 DNA Marker、2×Taq PCR MasterMix、反转录试剂（PrimeScript RT reagent Kit），均为大连宝生物工程有限公司产品；病毒基因组DNA/RNA 快速抽提试剂盒，为 Axygen 生物科技有限公司产品。

1.3　引物设计与合成

根据GenBank中公开发表的各病毒基因序列，利用 Meg Align（DNAstar）、Primer Premier 7.0 软件设计引物，并由生工生物工程（上海）服务有限公司合成。引物信息见表 2。

表2 5 种病毒的引物信息

1.4　病料处理及病毒 DNA/RNA 提取

取适量病死猪病料（脑、肺、脾、肾、淋巴结和小肠等）放于研磨器中，按质量比 1:5 加入灭菌生理盐水，在组织研磨器内进行研磨使其呈糊状，然后移入灭菌 EP 管中，反复冻融 3 次，4 ℃条件下 10 000 r/min 离心 5 min，取上清进行 DNA/RNA抽提或保存于 -70 ℃ 冰 箱 备 用。 按 照 AxyPrepBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit 使用说明书，对样品上清进行 DNA/RNA 提取，对所获得的 DNA/RNA 直接进行 PCR/RT-PCR 或置于 -70 ℃保存。

1.5　病毒目的基因片段扩增

1.5.1 CSFV、PRRSV 和 PEDV 的 RT-PCR 检测　利用特异性引物，对提取的样品 RNA 进行RT-PCR 扩增。反转录体系 10 µL：RNA 模板 7 μL，5×Prime-ScriptTM 缓冲液 2 μL，RT Enzyme Mix0.5 μL，下游引物 0.5 μL。反转录条件：42 ℃40 min，94 ℃ 5 min，反应产物于 -20 ℃保存备用。

PCR 扩增体系 25 μL：2×Taq PCR Master Mix12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，反转录产物（cDNA）3 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 扩增反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，按表 2 退火温度退火30 s，72 ℃延伸 45 s，共 35 个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后取 10 μL PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后在凝胶成像系统上观察。

1.5.2 PCV2 和 PRV 的 PCR 检测　利用特异性引物，对提取的样品 DNA 进行 PCR 扩增，PCR 扩增体系同 1.5.1。PCV2 的 PCR 扩增反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 40 s，按表 2 退火温度退火 40 s，72 ℃延伸 70 s，共 35 个循环；72 ℃延伸 10 min。PRV 的 PCR 扩增反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，按表 2 退火温度退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共 35 个循环；72 ℃延伸 10 min。

1.6　数据处理与分析

利用广西兽医研究所病毒室建立的 PCR/RTPCR检测方法，对采自14个地级市的2 104份样品，分别进行 CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PEDV 5种病原检测，并分析病原的混合感染情况及其地区和季节分布特点。同一份样品同时检测到 2 种病原归为二重感染，同时检测到 3 种病原归为三重感染，依次类推。使用 SPSS 19.0 软件，分析 5 种病原感染的显著性差异。

2　结果与分析

2.1 RT-PCR/PCR 检测

上述 5 种病原经特异性引物扩增，PCR 产物电泳后，在紫外线光下可观察到大小分别为 288 bp（CSFV）、738 bp（PRRSV）、1 154 bp（PCV2）、217 bp（PRV）和492 bp（PEDV）的目的条带（图1），分别与预期片段大小相符，表明本试验设计的引物特异性强。

首页前一页12345后一页尾页