PCR入门知识

6.向PCR反应体系中添加模板（核酸）的顺序。

向PCR反应体系中添加模板时，按照阴性对照，待检样本，阳性对照的顺序添加，在添加模板时只让正在添加的PCR反应管处于打开状态，其余均处关闭状态。能有效降低交叉污染的概率。

7.扩增后PCR反应管的处理。

扩增反应结束后PCR反应管直接10%次氯酸钠（or75%酒精）浸泡消毒，消毒后按普通医疗废物处理。如果不想你的实验室被气溶胶污染的话，经过扩增反应的PCR反应管千万不要再次打开！经过扩增反应后的PCR反应管内可能有大量的DNA产物，开盖极易产生气溶胶的污染。

随着科技日新月异的发展，市场上出现了形形色色的成品试剂盒，诸如qPCR、ELISA、生物芯片、生化、化学发光等等。涵盖了医疗、食品安全及畜牧等诸多行业。在给实验人员带来极大便利的同时，大大降低了检测实验对人员要求的准入门槛。

本章节仅以畜牧行业中的qPCR商品化试剂盒为例，简单的介绍其所涉及的理论和简单的数据分析。

既然是qPCR试剂盒，首先我们需要知道什么是PCR，什么是qPCR。若结果进行数据分析就必须要理解什么是阈值（线），什么是Ct值，什么是特异性扩增曲线。

一、什么是PCR？

PCR(聚合酶链式反应)指在体外模拟DNA在体内的扩增过程，然后对产物进行分析。如果检测的目标物为RNA，则先反转录为DNA，再进行DNA的扩增。

二、什么是qPCR？

qPCR（实时荧光定量PCR）在DNA上标记荧光染料或荧光探针（DNA形成双链结构时才释放荧光信号），荧光信号随扩增反应的进行依次递增。通过荧光信号的强度达到阈值线时所经历的循环数（Ct值）来衡量初始模板（DNA or RNA）的量。

三、什么是阈值（线）？

PCR仪并非是只要检测到荧光信号就确定目标物存在，PCR仪确定目标物确实存在需要一个最低的荧光信号强度。这个最低的荧光信号强度即为阈值。而阈值线即为穿过阈值（Y轴为荧光信号强速）平行于X轴（X轴为反应所经历的循环数）的直线。

一般情况下，PCR仪会将反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍，自动设置为阈值（缺省设置）。

此外如果样本的荧光背景值偏高，缺省设置的情况下出现Ct值但没有出现特异性扩增曲线，此时需要将阈值线人为调高，刚好超过阴性样本荧光信号的最高值。（手动设置）。

四、什么是Ct值？

PCR反应中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经历的扩增循环次数。

（1）Ct值是一个特定的循环数

（2）目标物经过这个循环数的扩增后，积累的荧光信号强度刚好达到阈值线的要求。

五、什么是特异性扩增曲线？

初始模板（待检核酸）在PCR反应的初期为2n曲线形状，随着反应的进行，反应液中的核苷酸量减少及酶活性降低，扩增曲线相较于2n曲线其上升趋势逐渐降低最终趋于平缓。形状很重要，直接见下图：

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