PCR入门知识

随着科技日新月异的发展，市场上出现了形形色色的成品试剂盒，诸如qPCR、ELISA、生物芯片、生化、化学发光等等。涵盖了医疗、食品安全及畜牧等诸多行业。在给实验人员带来极大便利的同时，大大降低了检测实验对人员要求的准入门槛。

本章节仅以qPCR在畜牧行业的应用，简单的介绍一下作为一名畜牧行业的一线实验人员所须具备的实验意识。

1.试剂经冻融后的取用。PCR试剂大多需-20℃保存，试剂复融后在使用前需要先涡旋震荡然后低速离心。因为经过冻存复融后，试剂内的溶质可能会出现分布不均一的情况，所以使用前需涡旋震荡，保证试剂的均一。在冻存的时候，因摆放的原因可能会造成试剂吸附在所在容器的侧壁甚至是封口帽处，如不经离心一是可能取液时无法取到所需液体；二是若液体吸附在封口帽处，在开封时会造成液体的飞溅和对试剂的污染。

2.抗凝采血管的选择。若检测样本为抗凝全血，需使用紫色帽（EDTA）的采血管采血。不能使用绿色帽（肝素）的采血管采血。肝素对Taq 酶具有强抑制的特性，会抑制PCR反应的进行。

3.实验耗材取用的次序。在实验前将本次实验所需的枪头、离心管、PCR反应管等准备好，严禁在实验的过程中再去包装袋中取用上述耗材。实验前取用，此时的手套相对干净；实验中取用，则大大增加了耗材整体被污染的风险。

4.移液器枪头的安装。移液器安装枪头时，移液器对准枪头尾部垂直向下轻压，再左右轻旋手腕（移液器一直保持垂直状态）；严禁通过移液器与枪头的反复撞击来安装枪头（反复撞击会对移液器造成较大磨损，容易出现气密性不好、漏气的情况，最终造成取液量和加液量的不准）。

5.加液的顺序和注意事项。向大体积的反应体系中添加小体积的液体，枪尖需没入液面之后排出液体，然后将枪尖移至距排出液体最远处再吸取液体排至第一次排出液体处，重复3次（不能在原处润洗枪头，液体排出枪头后会在液体排出处形成局部的大浓度环境，润洗效果不佳），保证小体积液体最大程度的转入大体积的反应体系中，减小在移液器枪头内的残留。（举例：向PCR反应液添加反应模板<待检核酸>）由于取液量少，一定要注意a取液是否足量取到b加液是否足量加入。严禁在反应体系的液面之上贴壁添加液体！容易出现液体未添加进下面反应体系的情况，哪怕后续有瞬时离心的操作。

正确操作                              错误操作

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