布鲁氏菌病实验室诊断方法研究进展

       2.2.4 胶体金标试验(GICA）
       GICA是用胶体金作为示踪标记物，用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。朱明东[9]等人的研究证明，GICA操作简单，血清用量少，反应快速，可以用于布病的初筛、现场疫情快速诊断和流行病学调查等。朱明东对GICA在布病不同流行地区的现场应用效果的比较，证明GICA不仅可以及时快速发现患者，而且可以监测疫情，反映流行程度，具有较好的推广应用前景。程婷婷建立的GICA方法，鉴别诊断了布鲁氏菌自然感染和人工免疫，区分了牛、羊种布鲁氏菌感染，可在基层推广使用。但是该方法只能定性诊断，不能实现定量测定，其质控指标和灵敏度也需进一步提高。

2.2.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA是20世纪70年代发展起来的一种灵敏性高、特异性强的高效的抗体检测新技术。该方法操作方便，既可以作为确定诊断，又可以作为筛选和鉴别诊断。在布病检测中，只有牛布病ELISA是国际贸易指定的，并主要用于血清和乳样中的抗体检测

目前用于布病检测的ELISA有间接ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)两种。ELISA首次用于布病检测，敏感性比SAT高出1~100倍。目前布病ELISA试剂盒选用的抗原主要是LPS-S，而该抗原在LPS的O链上，但粗糙型布鲁氏菌缺乏O链，所以基于LPS-S抗原的检测方法无法检测到粗糙型布鲁氏菌产生的抗体。

同时，虽然ELISA灵敏度高，特异性强，但并不能区分免疫接种产生的抗体还是自然感染产生的抗体。同时，还存在不能有效排除耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157感染动物的血清干扰，从而使ELISA方法的特异性受到一定程度影响。但仍然被OIE列为诊断牛布病的推荐方法。

2.2.6 全乳环状凝集试验(MRT)

全乳环状试验方法主要用于泌乳奶畜的布病初筛。MRT本质是抗原抗体反应，当乳汁中存在布病抗体时，红色的抗原抗体复合物就会转移至乳脂层，从而形成紫红色的乳脂环。该方法操作简便，反应时间短，避免了因采血难而带来的诸多弊端，可用于大规模奶牛筛查检测，大大提高了奶牛布病监测工作进度。但该方法不适用于检测患乳房炎及其他乳房疾病母牛的乳、初乳、脱脂乳和煮沸过的乳以及腐败、变酸和冻结的乳。

2.3 分子生物学诊断

分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、实时荧光定量PCR(RT-PCR)、核酸探针检测、环介导等温扩增技术(LAMP)。

2.3.1 PCR检测

PCR技术作为一种快速、准确、灵敏、高效的基因诊断技术已成为当前布鲁氏菌病分子生物学检测和病原学分型的重要手段。目前，普通PCR主要是通过检测编码布鲁氏菌BCSP-31和Omp外膜蛋白基因的原理。但是单对的引物不能区分鉴别布鲁氏菌生物型。

1990年，PCR在布病的应用首次报道，从此应用分子生物学诊断布病迅速发展。1994年，Bricker建立了AMOS-PCR检测方法，是最早建立的布病多重PCR，实现了一个反应体系同时检出多种布鲁氏菌生物型，具有很好的使用价值。后经过改进，该方法鉴别菌种的类型进一步完善。钟旗等人用该方法进行布病研究，发现AMOS-PCR的特异性、灵敏性均高于细菌分离和血清学诊断方法。叶勇刚建立的奶牛布病PCR方法，可有效检出奶牛布鲁氏菌，且最低可检出1CFU的DNA.豆玲[21]建立的布鲁氏菌与炭疽菌的多重PCR方法，最低可检出345fg/uL的含量DNA。

2.3.2 RT-PCR检测

荧光定量PCR是在PCR基础上发展起来的新技术，最大的优点就是通过捕捉实时荧光信号对扩增的布病核酸进行标量，直观的将结果呈现在电脑上。

2000年，Redkar用荧光标记引物探针，建立了可以特异性检测牛、羊、猪布鲁氏菌的RT-PCR方法。刘志国[23]等人建立的基于Taqman探针的多重荧光PCR实现了在快速检测布病的同时还能鉴别诊断是牛种还是羊种布病。

目前，RT-PCR是最灵敏、最准确的检测样品中核酸含量的方法，该方法克服了PCR在平台期的误差，实现了核酸的准确定量，避免了电泳造成的污染和误差。但是该方法需要有特殊的设备，且成本较高，因此不适于在基层推广和现场检测。

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