非洲猪瘟病原学诊断

非洲猪瘟(African Swine Fever ,ASF)是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，又称非洲猪瘟疫或疣猪病。目前缺乏针对非洲猪瘟的有效疫苗，且非洲猪瘟的传播非常迅速。由于非洲猪瘟引起的临床症状跟猪的其他一些传染病相似，根据临床症状很难进行鉴别诊断，因此实验室诊断和严格的生物安全措施对该病的防控至关重要。目前，国际上主要通过病原学和血清学方法进行非洲猪瘟的诊断。然而，该病在我国属于外来病，非洲猪瘟引起的临床病程短、发病急，通常在病毒抗体产生之前，动物已经发病死亡。因此，目前我国非洲猪瘟的检测主要应用病原学检测方法。本文主要对目前常用的非洲猪瘟病原学检测技术进行综述。

非洲猪瘟病毒可引发从最急性、 急性到慢性和表现健康实际带毒的一系列广泛症状。根据毒株之间毒力的不同，非洲猪瘟产生的临床症状也有所不同。其中，急性症状是最为常见的（3-5天），5-10天左右致死。慢性症状则通常表现为消瘦，肿胀和呼吸道问题。非洲猪瘟的临床症状主要表现为发热、出血以及皮肤发绀，甚至出现血块。病理剖检后通常可见脾脏异常肿大和淤血，淋巴结、肝脏和肾脏出血，这些临床症状与古典猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病等很难区分，因此一般通过实验室手段进行非洲猪瘟的鉴别诊断。快速，灵敏并且特异的检测技术对于非洲猪瘟的防控是至关重要的，不仅可以预防非洲猪瘟病毒的传播扩散，更有助于区分与非洲猪瘟有相似临床症状的一些疾病。

一、病毒分离

非洲猪瘟病毒可以通过血液、血清以及其他组织样品（脾脏、肝脏、淋巴结和扁桃体）等进行分离。如果样品中存在非洲猪瘟病毒，感染细胞中会产生明显的细胞病变（CPE）。非洲猪瘟病毒的红细胞吸附实验是其特有的检测技术，其它猪源病毒在白细胞培养物中不存在红细胞吸附特性。细胞病变通常出现在红细胞吸附48-72小时后，红细胞吸附反应（HAD）是基于猪源红细胞会吸附在感染非洲猪瘟病毒的单核巨噬细胞周围从而产生红细胞吸附的现象。该试验需要非洲猪瘟病毒在猪的原代骨髓细胞、肺泡巨噬细胞或外周血白细胞中培养，试验方法已经在世界动物卫生组织（OIE, 2012）手册详细描述。红细胞吸附试验方法的主要缺点是需要制备原代细胞，而且证明它的阴性结果至少需要6天。然而，如果红细胞吸附试验在前24h为阳性的话，通过红细胞吸附试验进行的病毒分离是优先于ELISA，PCR以及荧光抗体试验（FAT）。即使使用其他方法以及验证非洲猪瘟病毒为阳性的情况，通常建议使用红细胞吸附试验进行确诊，尤其是检测首次爆发或首例非洲猪瘟疫情。

二、非洲猪瘟病毒抗原检测

1. 荧光抗体试验

荧光抗体试验用来检测疑似病例组织中的非洲猪瘟病毒。试验方法是将疑似病例的组织或器官涂抹在载玻片或冷冻切片切成薄片，使用荧光素标记的特异抗体染色后通过显微镜观察非洲猪瘟病毒的抗原。荧光抗体试验也可以检测红细胞吸附阴性的白细胞，同时也可以鉴定没有红细胞吸附现象的非洲猪瘟病毒株。虽然荧光抗体试验对非洲猪瘟急性期的检测非常敏感，但对于亚急性和慢性症状，由于抗原抗体复合物的形成阻碍了非洲猪瘟抗原表位簇与标记荧光素抗体的结合，导致该试验的敏感性会降低。

2. 抗原检测ELISA技术

ELISA技术可以用于非洲猪瘟病毒抗原的检测，但只适用于急性症状的非洲猪瘟感染，但抗原检测ELISA不如PCR方法敏感。首次研究的间接ELISA方法检测非洲猪瘟病毒抗原的浓度范围在50-500HAD50/ml，之后以VP72的单克隆抗体建立的夹心ELISA方法提高了试验的敏感性。据报道，目前使用的两种双抗夹心ELISA检测试剂盒，一种是使用多克隆抗体，另一种是结合使用单克隆和多克隆抗体。两种方法都可以检测到较为广泛的非洲猪瘟毒株，但相比单克隆抗体，使用多克隆抗体检测非洲猪瘟病毒抗原要较为敏感。

三、非洲猪瘟病毒分子生物学试验检测

非洲猪瘟病毒的基因组大小在170到190kb之间，一条线性双链DNA分子，编码至少150个蛋白。根据不同毒株的差异，编码的蛋白数目也有所不同，据报道非洲猪瘟病毒可以分为24个基因型。分子生物学检测方法，通常基于保守基因设计引物，能保证扩增到所有基因型的非洲猪瘟病毒。目前OIE非洲猪瘟参考实验室将实时荧光定量PCR当作检测非洲猪瘟病毒的金标准。相比实时荧光PCR而言，等温扩增的分子检测方法价格低廉，在发展中国家应用具有很大的潜力。

1. 聚合酶链式反应（PCR）

针对非洲猪瘟病毒基因的检测，已经研制出很多种常规PCR方法。虽然这些方法目前都被实时荧光定量PCR所代替，但是在一些没有实时荧光定量检测设备的实验室，常规PCR仍然非常有用。

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