《禽白血病净化技术规范》团体标准

D.1.2.1.6含禽脑脊髓炎病毒的制品通常按照如下程序进行:取稀释的疫苗2.0mL，加入等体积的禽脑脊髓炎病毒特异性抗血清进行中和(禽脑脊髓炎病毒一鸡痘病毒二联苗，则先按含鸡痘病毒的制品进行滤过处理)，接种于CEF单层。

D.1.2.1.7鸡传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒的制品通常按照如下程序进行:不中和，直接取稀释后的制品2.0mL(含500羽份)接种于CEF单层。

D.1.2.1.8含呼肠孤病毒的制品通常按照如下程序进行:取1 000(或以上)羽份制品，用4. 0 mL(或适量)不含血清的M-199培养液溶解，使最终为500羽份/2. 0 mL;  2--8°C,  10 000 g离心10分钟;上清液经0. 45 }m滤器过滤，取2.0mL滤液与等体积的鸡呼肠孤病毒特异性抗血清混匀，置37℃作用60分钟，全部接种于CEF单层。

D.1.2.1.9含重组病毒的活疫苗按疫苗载体病毒方法进行处理。

D.1.2.1.10细胞液样品通常按照如下程序进行:取最后的细胞悬液5.0mL，反复冻融3次;5 000 g离心10分钟，取上清液用于接种CEF。

D.1.2.2接种与培养    处理好的样品接种2个25c了左右的CEF单层，置37℃吸附45--60分钟，弃去接种液，加入细胞生长液，次日换成维持液。同时设立接种RAV,和RAVz 0. 5mL的病毒对照组，以及正常细胞对照组。

D.1.3细胞培养的传代与处理

待细胞培养5--7日后，按常规方法消化、收获细胞，将其中1/2细胞，置一60℃以下作检验用(P1)，其余细胞分散到2个瓶中。培养5--7日后，按同样方法收获细胞，留样(P2)。如此继续传第3代，收获(P3)。所有对照组按相同方法处理。

将P1,  P2,  P3的细胞培养物(包括样品和所有对照组)冻融3次，5 000 g离心3分钟，取上清液用于禽白血病病毒检测。

D. 2接种SPF鸡检查法

按照疫苗说明书，将待检测疫苗接种规定日龄的SPF鸡一定时间后(通常为42 d )，使用禽白血病A/B亚群和J亚群的ELISA抗体检测试剂盒，分别检测血清中相应抗体，据此判断待检测疫苗是否存在外源性禽白血病毒污染。使用该方法检测弱毒疫苗中禽白血病病毒污染需要注意:一是避免免疫耐受性感染，慎用低日龄SPF鸡;二是要确保试剂盒质量可靠，排除抗体检测ELISA试剂盒假阳性结果的影响;三是每个疫苗应接种10只以上SPF鸡，用以消除鸡对禽白血病病毒易感性的个体差异影响。

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