《禽白血病净化技术规范》团体标准

B. 2抽检要求

表B. 1净化评估抽样检测方法

附录C

(资料性附录)

禽白血病病毒p27蛋白抗体ELISA检测操作程序

C. 1仪器设备

酶标仪(含450 nm波长滤光片)、50ul和100ul的精确微量移液器、200 ul八或十二通道可调移液器、一次性移液器吸头、稀释用96孔板、37°C孵育箱、1 000 mL量筒(配制洗涤液用)、蒸馏水或去离子水、自动或手动洗板系统等。

C. 2材料

禽白血病p27抗体EL工SA检测试剂盒。

C. 3操作

C. 3. 1样品采集

经翅静脉采血，分离血清，要求血清清亮、无溶血。短期内使用可置于4℃保存，否则应置于-20°C以下冻存。

C. 3. 2试剂盒检测

C. 3. 2.1检测原理

本试剂盒使用纯化的p27蛋白包被微量反应板，利用间接ELISA原理进行检测。如果待测样品中含有针对ALV-p27的抗体，则与包被抗原结合，加入可与鸡抗体结合的酶标二抗(酶结合物)后，形成抗体-抗原一酶标抗体复合物，再加入TMB底物液作用显色，在酶标仪450 nm波长测定各孔吸光度值，判定结果。

C. 3. 2. 2洗涤液的配制

使用前，浓缩的l0X洗涤液应恢复至室温(25℃左右)，并摇动使沉淀的盐溶解，然后用蒸馏水或去离子水作10倍稀释(例如:每板用40 mL浓缩液加360 mL水)，即1X洗涤液。

C. 3. 2. 3样品准备

用样品稀释液将阴阳对照样品和被检样品进行500倍稀释(如:1ul样品稀释到500ul)。

C. 3. 2. 4检测步骤

使用前所有试剂应恢复至室温(25℃左右)

1)取出反应板，在记录表上记录阳性对照、

2)分别在相应孔中加入稀释好的阳性对照

混匀后，贴上封板膜，置37℃孵育60 min;试剂应轻轻旋转或振荡混匀。

阴性对照和样品的位置;(2孔)、阴性对照(2孔)和待检样品各100ul。充分混匀后，贴上封板膜，置37℃孵育60 min;

3)小心揭掉封板膜，弃去各孔中液体、拍净。每孔加满洗涤液，静置约30 s，重复洗涤3次，最后在吸水纸上拍净;

4)每孔加入酶结合物溶液100匹，贴上封板膜，置37℃孵育60 min;

5)重复步骤3);

6)每孔加入底物液A 50匹和底物液B 50匹，轻轻振荡混匀，置室温避光显色15 min;

7)每孔加入终止液50匹，轻轻振荡混匀，立即置酶标仪450 nm波长处测定各孔OD值。

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