2016—2018年我国部分猪群塞尼卡病毒回顾性监测

塞尼卡病毒（Senecavirus A，SVA）曾用名塞  尼卡谷病毒（Seneca Vally virus，SVV），是最近新发现的可以感染猪的一种单股 RNA 病毒，属于小核糖 RNA 病毒科。SVA 最初从转化的胎儿成  视网膜细胞 PER.C6 的细胞培养基中被发现和分离到，并用于人溶瘤病毒治疗。后来发现猪也可以  感染 SVA，并且发现发病猪的鼻吻部、蹄部冠状带  等部位可以出现水泡样病变。这种病变在临床上与口蹄疫、猪水泡性口炎、猪水疱病、猪水泡性疹等疾病十分相似，仅靠临床诊断很难鉴别。近年来，SVA 在猪群的感染范围呈现逐年扩大趋势，美国、加拿大、巴西、中国、泰国、哥伦比亚等养猪  业较发达国家先后从出现水泡病的猪病料中检测到  SVA。2015 年夏天，我国广东省某猪场发生了水泡样疾病，在排除口蹄疫、猪水疱病、猪水泡性口  炎等疫病后，证实感染病原为 SVA，且分离到 SVA  毒株 CH-01-2015。该毒株与参考毒株 SVV-001 的  同源性为 94.4%~97.1%，这是我国首次报道猪场感染 SVA 。随后，我国学者又分别从湖北、黑龙江、福建、河南等省份出现水泡病的猪病料中先后检测  到 SVA。这些研究提示，我国猪群 SVA 的感染状况较为严重。但上述研究分离检测到 SVA 的样  品均为发病的水泡样品，并没有针对 SVA 开展系  统的流行病学调查和监测。一些流行病学信息，特别是未表现症状的外观健康猪群是否携带 SVA 更是亟待摸清。为此，针对 2016—2018 年从部分省  市屠宰场和表现非水泡状猪群采集的样品，开展 SVA 回顾性监测，以了解 SVA 在我国猪群的感染  程度和分布规律。

  1、材料与方法

  1.1 样品与来源 

 458 份组织混合样品和 95 份血清样品：2018  年采集自广西、云南、新疆、辽宁、福建、湖南、湖北等 7 省份的屠宰场；病料样品 164 份：2016—2018 年采自辽宁、河北、湖北、湖南、江西、四川、山东、上海、贵州、吉林、陕西、云南等12省份，其中 2018年84份、2017 年 32 份、2016年48份。采集样品时，每头猪采集适量的扁桃体、脾脏、肾  脏、淋巴结、肺脏等混在一起，作为一个样品进行  处理和检测。 

 1.2 主要试剂 

 Premix RT-PCR 探针法一步法扩增试剂盒、  pMD-18T vector 和 DH5α 感受态细胞：宝生物工  程（大连）有限公司产品；病毒 RNA 提取试剂盒  （TRIzol）：Life 公司产品。 

 1.3　样品处理与 RNA 提取  

将样品称重后加入 4 倍体积的 PBS（0.01 mol/L，  pH7.2）进行研磨，待全部乳化后，以 8 000 r/min 离  心 5 min，取上清液提取 RNA。同时用本室分  离和鉴定的 SVA 病毒 GXT91 作为阳性对照，用  PBS 作为阴性对照，同步提取 RNA。RNA 提取  按照 TRIzol 试剂盒操作说明书进行，简述为：  取 0.25 mL 样品上清液，加入 0.75 mL TRIzol  混匀，再加入 0.2 氯仿混匀；室温静置 5 min，  12 000 r/min 离心 5 min；取上清液加入等体  积异丙醇，12 000 r/min 离心 5 min，保留沉淀；  加入 1 mL 70% 乙醇洗涤 1 次，然后加入适量  H2O 溶解，置 −70 ℃备用。对阳性样品接种的  细胞上清液，也按照此法提取 RNA。 

 1.4　样品检测  

本研究使用荧光 RT-PCR 方法，对样品中的  SVA 核酸成分进行检测，根据 GenBank 公开的我国 SVA 毒株序列（KY419132）为靶基因序列设计引物。上游引物为 SVA-F：ctgcgctgggaccgtatctca；  下游引物为：SVA-R：cgccgcgccacctcatt；荧光引  物 为 SVA-P：5'-FAM-tgccgccaagtttcaatcccatcctgg-  3'-BHQ1。反应体系为：2×Premix 12.5 μL，SVAF  引物（10 μmol/L）1 μL，SVA- R 引物（10 μmol/L）  1 μL，SVA- P 引物（5 μmol/L）1 μL，样品 RNA  模板或阳性标准品 2 μL，加水至 25 μL。RT-PCR的反应程序为：42 ℃ 5 min，95 ℃预变性 3 min，  40 个扩增循环（95 ℃ 8 s、60 ℃ 16 s），60 ℃读  取荧光。SVA 的判断标准为：Ct ＜ 35 为阳性，  35 ≤ Ct ＜ 37 为可疑，Ct ≥ 37 为阴性；可疑者  重复检测 1 次，如果仍可疑或阴性，则判为阴性，  如果为阳性，则判为阳性。 

 1.5　结果分析  根据监测结果，使用 Excel、ArcGIS 等软件进  行分析，摸清 SVA 的三间分布。

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