山东地区新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定

摘要：为了解山东地区肉鸭呼肠孤病毒的流行情况，本研究从山东地区收集肉鸭坏死脾脏病料，经研磨处理，接种鸭胚，对分离病毒进行PCR扩增和σC基因测序分析。PCR扩增结果显示共分离得到6株病毒，测序结果显示，6株病毒σC基因核苷酸同源性为99.0-100.0%，与新型呼肠孤病毒毒株核苷酸同源性为93.7-99.3%。由此确定，分离的6株病毒均为新型呼肠孤病毒（Novel duck reovirus, NDRV）。该研究为山东地区NDRV的防控提供一定参考依据。

自2005年以来，在广东、四川、福建、浙江、安徽等省份陆续报道雏番鸭、雏半番鸭、麻鸭群中出现一种新的病毒病，以肝脏和脾脏不规则坏死、出血为主要特征，给当地水禽养殖业造成重大损失，经病毒分离鉴定为新型呼肠孤病毒（NDRV）。2006年刘红等首次从北京鸭脾坏死病料中分离到一株NDRV，随后，陆续从番鸭、北京鸭、鹅等水禽中分离到NDRV[3-8]。NDRV同番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）均属于正呼肠孤病毒属，但不同于MDRV的是其感染宿主的范围更广，主要以脾出血、坏死为典型症状，且阻碍雏鸭生长，现已成为危害养鸭业重要传染病之一[9,10]。

为了解山东地区肉鸭呼肠孤病毒的流行情况，本研究从山东省不同地区发病鸭中收集到6份病料，通过鸭胚分离得到6株病毒，经PCR扩增、克隆测序证实，该病毒是NDRV。

一.材料和方法

1.1材料

1.1.1病料来源和鸭胚

病料来自2017年12月至2018年3月份山东菏泽、临沂、潍坊等地区部分肉种鸭和商品肉鸭养殖场饲养的发病雏鸭。6日龄鸭胚由山东省某孵化场提供。

1.1.2仪器和试剂

PCR仪购自Bio-Rad公司；全自动核算自动提取仪购自Thermo公司；磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒微量提取试剂盒购自AxyGen公司；10 mM dNTP Mixture, Random Primer, Recombinant RNase Inhibitor, M-MLV, Premix Ex Taq, DL2000 DNA Marker, pMD19-T Vector, E.coli DH5α Electro-Cells均购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.2方法

1.2.1病料的PCR检测

参照文献[11]取脾脏加入3倍体积生理盐水，低温研磨，取两支1.5 mL EP管各取1 mL研磨液，反复冻融3次，8000 r/m离心10 min，保存上清液。取200 μL上清液，用磁珠法DNA/RNA核酸共提试剂盒按其操作说明书，用全自动核酸提取仪提取核酸，用50 μL DEPC水洗脱即得DNA和总RNA，进行RT反应，得cDNA。

参照文献[1]，根据GenBank上公布的NDRV S1基因序列，利用Primer Premier 6.0设计一对扩增片段大小为373 bp的特异性鉴定引物，由上海生物工程有限公司合成。对获得的cDNA和DNA，用本实验室自行设计的新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)鉴定引物和本实验室已验证的鸭瘟病毒（DPV）引物[12]、农业行业标准（NYT772-2013）禽流感（AIV）M基因检测引物、鸭肝炎病毒（DHV）检测引物[13]、鸭细小病毒(GPV)检测引物[14]、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)检测[15]分别进行PCR检测。

1.2.2病毒的分离

取上述上清液，0.22 μm 滤器过滤，每份按0.1 mL/胚经卵黄囊接种3枚6日龄鸭胚，弃去24 h内死亡鸭胚，传1至3代。

1.2.3病毒σC基因的扩增和序列分析

收集病毒尿囊液各取200μL，按上述方法提取核酸并进行反转录，得cDNA。参照文献[16]根据GenBank上公布的NDRVS1基因序列，利用Primer Premier 6.0设计一对测序引物，RT-PCR扩增包含完整σC基因的一段长997bp的序列。用NDRV的σC基因测序引物进行PCR扩增。将σC基因扩增产物进行回收、连接并转化，筛选阳性进行质粒提取，鉴定后送上海生工测序。

二.结果

2.1发病鸭的症状和剖检变化

发病雏鸭出现零星死亡，个体偏小，剖检变化以脾脏坏死为主要特征。发病日龄均在3-15日龄，鸭群早期无明显特异性症状，零星死亡，有的鸭群持续到30d，死亡率在6-12%左右，后期鸭群体重不均匀。剖检变化以脾脏出血和坏死为主要特征。

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